食管鳞状细胞癌中microRNA-21与ERK1/2通路调控机制的研究

【摘要】目的：通过体外细胞实验研究microRNA-21和ERK1/2MAPK信号传导通路在食管鳞状细胞癌中的作用及作用机制；通过体内实验研究miR-21和ERK1/2在80例食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织及相对应的癌旁正常组织中的表达,分析二者之间的关系并探讨miR-21和ERK1/2与食管鳞状细胞癌患者临床病理学资料的关系及临床意义。方法：Lipofectamine2000转染miR-21mimics、inhibitor、随机序列、miR-21过表达质粒；U0126处理Eca109细胞,抑制ERK1/2MAPK信号传导通路活化；细胞计数和MTT检测细胞增殖；细胞划痕实验检测细胞迁移；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；qRT-PCR检测miR-21和ERK1/2mRNA;Western-blot免疫印迹法检测总ERK1/2和磷酸化ERK1/2；原位杂交技术检测和免疫组化方法分别检测80例食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中miR-21和ERK1/2的表达。结果：1)检测食管鳞状细胞癌细胞系EC9706.Eca109和KYSE510中miR-21的表达,miR-21中量表达的Ecal09选为研究细胞。将携带绿色荧光素标记的miR-21-I,miR-21-M,随机序列转染至Eca109细胞中,转染效率可达90%以上,miR-21-Ⅰ组中miR-21表达下调至0.15倍(P<0.05),miR-21-M中miR-21表达上调至8.85倍。细胞计数检测细胞增殖能力,miR-21-M组增高了6.15%(24h,P>0.05)、19.69%(48h,P<0.05)、11.69%(72h,P<0.05)、17.97%(96h,P<0.05),而miR-21-Ⅰ组抑制了10.35%(24h,P<0.05)、9.23%(48h,P<0.05)、16.03%(72h,P<0.05)、15.23%(96h,P<0.05);MTT实验检测细胞增殖能力,miR-21-M组增高了1.89%(24h,P>0.05)、9.6%(48h,P<0.05)、14.55%(72h,P<0.05)、9.62%(96h,P<0.05),而miR-21-Ⅰ组抑制了2.50%(24h,P>0.05)、43.32%(48h,P<0.05)、34.52%(72h,P<0.05)、38.57%(96h,P<0.05)。平板克隆实验检测克隆形成能力,miR-21-M组增加了11.03%(P<0.05),miR-21-I组减少了17.23%(P<0.05)。细胞划痕检测伤口愈合能力,miR-21-M组提高了14.50%(24h,P<0.05)、15.77%(48h,P<0.05)、24.35%(72h,P<0.05),miR-21-I组抑制了9.16%(24h,P>0.05)、14.93%(48h,P<0.05)、18.13%(72h,P<0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡率,miR-21-M组减少了82.61%(P<0.05),miR-21-I组增加了107.38%(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期,miR-21-Ⅰ组G1期增长了6.98%(P<0.05),S期缩短了33.33%(P<0.05),G2期缩短了16.04%(P<0.05),而miR-21-M组G1期缩短了30.26%(P<0.05),S期显著增长了136.60%(P<0.05),G2期增长了75.93%(P<0.05)。检测ERK1/2蛋白质表达,p-ERK1/2蛋白质表达在miR-21-M组中明显增高(P<0.05),在miR-21-I组中明显抑制。2)U0126处理Eca109细胞,细胞计数结果发现0126对Eca109细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性,20μmol/L浓度的U0126可明显抑制细胞增殖,改变Eca109细胞的正常形态结构。MTT检测细胞增殖,U0126组降低了18.93%(24h,P>0.05)、23.17%(48h,P>0.05)、43.08%(72h,P<0.05)、56.05%(96h,P<0.05);与U0126组相比,U0126+miR-21组细胞增殖能力显著增高：与miR-21组相比,U0126+miR-21组细胞增殖能力显著被抑制。平板克隆实验发现U0126组细胞克隆形成时间变晚,直径变小,形成数目减少了15.783%(P<0.05)；与U0126组相比,U0126+miR-21组细胞克隆形成数目增加了14.96%(P<0.05)；与miR-21组相比,U0126+miR-21组细胞克隆形成数目降低了12.11%(P<0.05)。细胞划痕检测伤口愈合能力,U0126组降低了23.83%(24h,P<0.05),59.50%(48h,P<0.05),180.52%(72h,P<0.05);与U0126组相比,U0126+miR-21组显著提高；与miR-21组相比,U0126+miR-21组显著降低。流式细胞仪检测细胞凋亡,U0126组增加了357.24%(P<0.05),miR-21组减少了78.61%(P<0.05)；与U0126组相比,U0126+miR-21组细胞凋亡减少了76.14%(P<0.05)；与miR-21组相比,U0126+miR-21组细胞凋亡增加了410.13%(P<0.05)；流式细胞仪检测细胞周期,U0126组G1期增加了6.42%(P<0.05),G2期减少了18.45%(P<0.05),S期减少了26.15%(P<0.05)；与U0126组相比,U0126+miR-21组细胞周期中G1期减少了6.36%(P<0.05),G2期增加了26.88%(P<0.05),S期增加了33.19%(P<0.05)；与miR-21组相比,U0126+miR-21组G1期增加了42.89%(P<0.05),G2期减少了41.18%(P<0.05),S期减少了58.43%(P<0.05)；检测ERK1/2的表达水平,U0126组中p-ERK1/2表达明显抑制(P<0.05)；与U0126组相比,U0126+miR-21组中p-ERK1/2表达明显增高(P<0.05)；与miR-21组相比,U0126+miR-21组中p-ERK1/2表达明显抑制(P<0.05)。miR-21表达检测发现,U0126组细胞中miR-21表达降低了93.77%(P<0.05)；与U0126组相比,U0126+miR-21组中miR-21表达增加了14.48倍(P<0.05)；与miR-21组相比,U0126+miR-21组细胞中miR-21表达减少了93.26%(P<0.05)。3)miR-21在80例食管鳞状细胞癌组织中阳性表达率为96.25%,癌旁正常组织中的阳性表达率为71.25%(P<0.05);miR-21在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中miR-21表达量比癌旁正常组织中增多了174.50%(P<0.05)。p-ERK1/2在80例食管鳞状细胞癌组织中阳性表达率为91.25%,在癌旁正常组织中的阳性表达率77.50%(P<0.05)；p-ERK1/2在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中的表达量增多了163.41%(P<0.05)。miR-21和p-ERK1/2在食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织的表达具有相关性(P<0.05),相关系数为0.570。miR-21和p-ERK1/2的表达在有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达显著增高(P<0.05),但在食管鳞状细胞癌不同性别、年龄、民族、病理类型、肿瘤侵及范围和肿瘤大小间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1)miR-21在食管鳞状细胞癌Eca109细胞系中可能通过正调控ERK1/2MAPK信号传导通路活化促进细胞增殖、迁移、克隆形成,促进细胞生长周期由G1期大量进入在S期和G2期,缩短细胞生长周期,加快细胞增殖速度,并且抑制细胞凋亡;2)ERK1/2MAPK信号传导通路活化抑制在食管鳞状细胞癌Eca109细胞系中可能通过降低miR-21表达水平抑制细胞增殖、迁移、克隆形成,使细胞生长周期停滞在G1期,延长细胞生长周期,减慢细胞增殖速度,并且促进细胞凋亡；3)miR-21和p-ERK1/2在食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织的表达具有正相关性,miR-21和p-ERK1/2的表达在有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达显著增高,但在食管鳞状细胞癌不同性别、年龄、民族、病理类型、肿瘤侵及范围和肿瘤大小间的差异无统计学意义；4)miR-21和ERK1/2MAPK信号传导通路在食管鳞状细胞癌中具有协同作用并且相互调控,促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和淋巴结转移。
【作者】刘凤霞；
【导师】刘文亚；
【作者基本信息】新疆医科大学，外科学，2013，博士
【关键词】食管鳞状细胞癌；microRNA-21；ERK1/2；Eca109细胞；增殖；迁移；

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