异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果质量控制与体外活性研究

【摘要】目的：异常黑胆质成熟剂是维吾尔医常用临床复方制剂,是结合丰富的临床实践所研制的具有维吾尔医学特色的经典复方。复方由刺糖、破布木果、牛舌草、地锦草等十味药材组成。该制剂具有成熟单纯黑胆质性异常、利尿、消炎解毒等功能,主要用于治疗由异常黑胆质所导致的肿瘤、糖尿病和心血管疾病。本文目的为建立异常黑胆质成熟剂质量控制方法,完善组方药材破布木果的物质基础研究；建立异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果的定性定量分析；评价异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果的体外抗氧化活性；评价复方及其组方药材破布木果不同提取成分对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及对HCT116增殖的抑制作用；为异常黑胆质成熟剂及组方药材破布木果的临床应用提供基础研究资料。方法：1.采用薄层色谱定性鉴别方法,对异常黑胆质成熟剂及其组方单味药材进行TLC定性分析研究,总结异常黑胆质成熟剂及其单味药材中的薄层色谱行为。对破布木果药材进行果实形态、性状、显微、薄层鉴别研究,采用化学成分系统预试法对破布木果中的化学成分进行预实验研究,确定破布木果中化学成分类型；采用Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚含量；采用5%香草醛-冰醋酸和高氯酸比色法测定总三萜酸含量；采用2%茚三酮和磷酸缓冲液(pH=6.80)比色法测定总氨基酸含量。2.应用TLCS、HPLC-DAD、GC-MS对异常黑胆质成熟剂和破布木果进行定性定量分析。以TLCS法测定异常黑胆质成熟剂中芦丁、槲皮素、迷迭香酸、甘草酸含量；HPLC-DAD法测定异常黑胆质成熟剂中6种酚性成分：没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芦丁、迷迭香酸、木犀草素及甘草酸的含量,根据标准品、供试品和含标准品的供试品三者色谱图中相应色谱峰的保留时间和紫外光谱数据,对异常黑胆质成熟剂所含6种酚类化合物及甘草酸进行定性鉴定及定量分析。由薄层定性分析可知异常黑胆质成熟剂中破布木果、香青兰、小茴香、牛舌草、薰衣草均含有迷迭香酸,对破布木果中的迷迭香酸进行了HPLC-MS2法定性、HPLC法定量测定。采用C6-C20正构烷烃系列标样与异常黑胆质成熟剂挥发油混合,通过GC-MS测定,得到异常黑胆质成熟剂挥发油的总离子流图,经美国NIST07andNIST07s质谱库与保留指数检索,分析确定各化学成分,采用峰面积归一化法计算各组分的含量。3.对异常黑胆质成熟剂和破布木果提取液进行抗氧化活性研究,建立清除羟基自由基,清除超氧阴离子、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、超氧化物歧化酶活性率(SOD)四种抗氧化模型,对不同溶剂提取物及不同抗氧化模型之间的差异进行比较研究。采用刀豆蛋白ConA(刺激T淋巴细胞的专属试剂)和LPS(刺激B淋巴细胞的专属试剂)试剂模型,考察异常黑胆质成熟剂、破布木果提取液和迷迭香酸对照品对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。采用人结肠癌细胞株(HCT116)作为研究对象,MTT法检测不同浓度异常黑胆质成熟剂、破布木果提取物及迷迭香酸对照品对细胞增殖的抑制作用。结果：1.经过优化薄层色谱实验条件,表明异常黑胆质成熟剂与各药材以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(15：1：1：1.5)为展开剂,展开完全,且条带清晰明显,其中异常黑胆质成熟剂与各药材相对条带一致性较好。甘草酸(Rf=0.11)和甘草苷(Rf=0.54)是异常黑胆质成熟剂(汤剂)组方药材甘草提供的特性成分。芦丁(Rf=0.17)由组方药材铁线蕨,薰衣草,小茴香,地锦草,刺糖提供：绿原酸(Rf=0.18)由组方药材铁线蕨提供；迷迭香酸(Rf=0.81)由组方药材破布木果,牛舌草,香青兰,薰衣草,小茴香提供。对破布木果单味药材进行了破布木果生药学研究,形态呈圆锥状卵形,常皱缩显纵状或网状不规则棱角,果皮横切面长椭圆形,切线延长,外被角质层；中果皮为薄壁组织,散有石细胞,并散有小型维管束。石细胞呈多角形、类圆形或长椭圆形,胚乳细胞多角形,含有拟晶体和大量油液；导管孔纹较多。果实纵径变异系数0.072%,果实横径变异系数0.129%,果形指数变异系数13.38%。破布木果中含有糖类、氨基酸及蛋白质、生物碱、鞣质、有机酸、挥发油、多酚类物质、黏液质。薄层鉴别研究,以甲苯：乙酸乙酯：甲酸(3：7：1)为展开剂分离效果较好。采用比色法测定了破布木果中总多酚、总三萜酸、总氨基酸,结果表明：80%乙醇提取液中总多酚和总三萜酸含量含量分别为1.00%、0.075%：水提液中氨基酸的含量为1.39%。2.采用薄层色谱扫描法从异常黑胆质成熟剂中定性定量分析4种化学成分,即芦丁(Rf=0.16)、迷迭香酸(Rf=0.79)、甘草酸(Rf=-0.09)、甘草苷(Rf=0.54),使用GF254板,乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(15：1：1：1.5)展开,分离效果良好,较硅胶G板和H板,不需要显色,且斑点清晰集中。在方法学考察中,标准曲线线性关系良好,回归系数R均大于0.999；精密度、稳定性、重复性、加标回收率良好,检测线(LOD)在27.5-38.17ng之间,定量限(LOQ)在91.80-127.26ng之间。在测定的3批异常黑胆质成熟剂中,迷迭香酸(1.8983±0.097mg/g)作为多数药材中的共性成分含量最高,其次是甘草酸(1.3847±0.047mg/g)、芦丁含量为0.3887±0.014mg/g,甘草苷含量为0.3253±0.007mg/g。采用反相高效液相色谱二极管阵列检测(RP-HPLC-DAD)梯度洗脱技术,保留时间、紫外光谱定性,峰面积定量方法,定性定量分析异常黑胆质成熟剂中6种酚酸类化合物,即没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芦丁、迷迭香酸、木犀草素。对色谱条件进行了优化,包括柱温,色谱柱的类型,提取溶剂,检测波长和流动相。分离条件确定为：色谱柱AgilentTC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；(2)流动相A相为0.3%的甲酸甲醇溶液,B相为含0.3%的甲酸水溶液,线性梯度程序为开始100%B;0～15min,100%～92%B;30min～50min,83%～75%B;50min-80min,75%～55%B;80min～100min,55%～40%B;流速1mL/min；柱温30℃；检测波长290nm；进样量为101μL。异常黑胆质成熟剂中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芦丁、迷迭香酸、木犀草素的含量分别为：0.481、0.0675、0.119、0.437、0.836、0.198mg/g,在方法学考察中,标准曲线线性关系良好,回归系数R均大于0.999；精密度、稳定性、重复性、加标回收率良好。参考《中国药典》(2010版)测定甘草酸的含量方法,在进行实验条件摸索后,采用了反相高效液相色谱二极管阵列检测(RP-HPLC-DAD)梯度洗脱法,甘草酸在异常黑胆质成熟剂中的含量为2.71mg/g,此方法准确、重复性好,可用于异常黑胆质成熟剂中甘草酸的含量测定。采用反相高效液相色谱串联质谱对破布木果中迷迭香酸进行了定性、定量分析,结合薄层色谱实验,通过与标准品的相对保留值和二级碎片质谱图比对可以确证化合物的结构。以正交试验设计对破布木果中的迷迭香酸进行优化提取,得到了最优提取条件：乙醇浓度为70%,料液比为1：35g/mL,超声时间为30min,超声功率为300W,在此条件下迷迭香酸含量为0.1071%。液质联用法定性准确可靠,液相色谱含量测定方法简单,重复性好。采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对异常黑胆质成熟剂挥发油化学成分进行了定性分析,经计算机质谱数据库检索与标准谱图比对、解析并参考文献,共鉴定出18种主要的化合物,其中反式茴香脑占83.97%以上,确定异常黑胆质成熟剂挥发油的主要成分为反式茴香脑,经面积归一化法处理得各组分的相对百分含量,根据已有文献,茴香脑为异常黑胆质成熟剂组方药材小茴香的主要成分,可知异常黑胆质成熟剂挥发油主要成分来自组方药材小茴香。3.建立了异常黑胆质成熟剂(汤剂)和其组方药材破布木果清除羟基自由基能力,清除超氧阴离子、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、超氧化物歧化酶活性率(SOD)四种抗氧化模型,异常黑胆质成熟剂抗氧化能力与阳性对照Vc比较相对较弱。破布木果不同提取物的抗氧化能力如下：对羟基自由基的清除作用总体趋势为：80%乙醇提取液>Vc>80%乙醇提取纯化液。对DPPH·自由基的清除作用总体趋势为：当溶液浓度<40μg/mL时,Vc>80%乙醇提取纯化液>80%乙醇提取液。当溶液浓度>80μg,/mL时,80%乙醇提取液>Vc>80%乙醇提取纯化液。对超氧阴离子自由基的清除作用总体趋势为：Vc>80%乙醇提取液>80%乙醇提取纯化液。SOD酶活性率总体趋势为：Vc>80%乙醇提取液>80%乙醇提取纯化液。破布木果80%乙醇提取液抗氧化能力总体趋势为：对DPPH·自由基的清除作用>对羟基自由基的清除作用>对超氧阴离子自由基的清除作用>SOD酶活性率。破布木果80%乙醇提取纯化液抗氧化能力总体趋势为：对DPPH·自由基的清除作用>对羟基自由基的清除作用>SOD酶活性率>对超氧阴离子自由基的清除作用。Vc抗氧化能力总体趋势为：对超氧阴离子自由基的清除作用>SOD酶活性率>对DPPH·自由基的清除作用>对羟基自由基的清除作用。建立刀豆蛋白ConA(刺激T淋巴细胞的专属试剂)和LPS(刺激B淋巴细胞的专属试剂)试剂模型,考察异常黑胆质成熟剂(汤剂)、破布木果提取液和迷迭香酸对照品对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。异常黑胆质成熟剂、破布木果粗提液、破布木果粗多糖在体外能显著提高小鼠脾淋巴细胞增殖。对小鼠脾淋巴细胞增殖作用总体趋势为：破布木果粗提液>迷迭香酸标准品>破布木果粗多糖>异常黑胆质成熟剂。采用人结肠癌细胞株(HCT116)作为研究对象,MTT法检测不同浓度异常黑胆质成熟剂(汤剂)、破布木果提取物和迷迭香酸对照品对细胞增殖的抑制作用。结果表明：异常黑胆质成熟剂提取物、破布木果水提物和迷迭香酸对照品对人结肠癌细胞株HCT116体外增殖的抑制具有一定的作用,其抑制作用总趋势为迷迭香酸对照品>异常黑胆质成熟剂提取物>破布木果水提物,而破布木果粗多糖人结肠癌细胞株HCT116体外增殖无抑制作用。结论：1.对异常黑胆质成熟剂及其组方药材进行薄层色谱研究,建立了异常黑胆质成熟剂及其各组方药材薄层色谱物质组成评价基础,研究方法及结果为异常黑胆质成熟剂的组分分离和质控方法提供了资料。异常黑胆质成熟剂由十味药材组成,其化学成分复杂,分离鉴定较难,通过异常黑胆质成熟剂与各单味药材、药材阴性对照及标准品对比Rf值和显色,鉴定其化学成分。破布木果经过化学成分预试验,初步可以判断破布木果含有糖类、氨基酸及蛋白质、生物碱、鞣质、有机酸、多酚类物质、黏液质。未检出香豆素、甾体和萜类、内脂、黄酮类。薄层色谱可定性控制破布木果质量,其所含化学成分在紫外灯365nm下多为蓝紫色。采用比色法测定了破布木果中总多酚、总三萜酸、总氨基酸。2.采用TLCS法定性定量分析了异常黑胆质成熟剂中甘草苷、甘草酸、芦丁和迷迭香酸的含量。采用RP-HPLC-DAD、梯度洗脱技术从异常黑胆质成熟剂中定性定量分析了6种酚类化合物(没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芦丁、迷迭香酸、木犀草素)和甘草酸。采用GC-MS法对异常黑胆质成熟剂挥发油化学成分进行了分析,共鉴定出18种主要的化合物,反式茴香脑占83.97%以上,方法稳定可靠。3.异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果的抗氧化实验提示,异常黑胆质成熟剂水提物、破布木果80%乙醇提取液和破布木果80%乙醇提取纯化液均具有抗氧化能力,为高效、安全、合理开发利用以及药材的质量控制提供一定的依据。破布木果对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用实验表明异常黑胆质成熟剂、破布木果粗提液、破布木果粗多糖在体外能提高小鼠脾淋巴细胞增殖。人结肠癌细胞株(HCT116)细胞增殖的抑制实验发现异常黑胆质成熟剂提取物、破布木果水提物和迷迭香酸对照品均具有一定的抑制作用,而破布木果粗多糖人结肠癌细胞株HCT116体外增殖无抑制作用。本文通过对异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果的质量控制研究及体外活性实验,建立了异常黑胆质成熟剂(汤剂)定性定量分析方法,完善组方药材破布木果的质量标准(草案),研究部分体外活性,为异常黑胆质成熟剂及组方药材破布木果的临床应用提供基础研究资料。
【作者】田树革；
【导师】哈木拉提·吾甫尔；
【作者基本信息】新疆医科大学，药理学，2013，博士
【关键词】异常黑胆质成熟剂；破布木果；质量控制；体外活性；

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