梨小食心虫Grapholita molesta(Busck)信息素结合蛋白相关基因的克隆、原核表达及功能分析

【摘要】本文从梨小食心虫化学感受器的外部形态入手，通过扫描电子显微镜，研究了梨小食心虫幼虫触角和口器、成虫喙和下唇须感器的形态、结构与分布特征；并采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）、cDNA末端快速扩增（RACEPCR）技术，克隆出梨小食心虫两个性信息素结合蛋白基因和一个普通气味结合蛋白基因，并对其表达和荧光结合特性进行了研究。具体研究结果如下：1．梨小食心虫幼虫触角感器由2个刺形感器、6个锥形感器和1个栓锥形感器组成。幼虫上唇有6对对称的刺形感器；内唇有3对扁的刺形感器、3对小的内唇感器和1对宽扁的指形感器；上颚除了末端的5个锯齿外，外侧近基部还有2个刺形感器；在下颚的轴节、茎节和外颚叶上各着生1个刺形感器，外颚叶还具有2个长扁粗的刺形感器、3个短而尖的锥形感器和2个肥大的栓锥形感器。在下颚须的末端具有7个锥形感器和1个栓锥形感器，侧面具有1个指形感器和2个板形感器；下唇有1个刺形感器和1个栓锥形感器，在下颚须和下唇须表面还均匀分布有许多感觉孔。另外，通过与其他昆虫感受器类型的比较，并对这些感受器的功能进行了分析和讨论。2．梨小食心虫喙上具有5种类型的感器：毛形感器、刺形感器、锥形感器（2个亚型）、栓锥形感器（2个亚型）和坛形感器。在下唇须的表面拥有3种类型的感器：刺形感器、鳞形感器和钟形感器，另外在下唇须第2节表面还零星地分布有小孔。下唇须末节顶端有1个开口21.90μm，深86.61μm的陷窝器，通过纵切发现，在陷窝器内有3种类型的感器：分叉或不分叉的毛形感器、乳状感器和叶形感器。3．从梨小食心虫触角中克隆出两个性信息素结合蛋白基因，即GmolPBP2（GenBank登录号：KF365878）和GmolPBP3（GenBank登录号：KF365879），分别包含510bp和495bp的开放阅读框，编码169和165个氨基酸残基，预测其N-末端分别具有25个和19个氨基酸残基组成的信号肽，氨基酸序列具有典型的气味结合蛋白家族的特征，即6个保守的半胱氨酸残基。基因组DNA都包含2个内含子，但它们的位置和长度各不相同。这两个基因仅在雌雄触角中特异性表达，GmolPBP3在雄虫触角中的表达量仅是雌虫触角表达量的57.0%，但GmolPBP2在雌雄虫触角中的表达量几乎相等（100:96.6），GmolPBP3在雌雄触角中的表达量分别是GmolPBP2的9.0%和5.3%；这两个基因在交配前与交配后表达量变化很大，说明交配行为对梨小食心虫性信息素的反应有显著影响。4．对梨小食心虫两个性信息素结合蛋白进行原核表达和蛋白纯化，并进行荧光竞争结合实验，结果显示，GmolPBP2与E8-12：Ac和Z8-12：Ac两种性信息素成分有强烈的结合力，其次是与Z8-12：OH和12：OH，与其它一些普通气味分子也有一定的结合力。而GmolPBP3与4种性信息素成分和普通气味分子结合力都很弱，说明GmolPBP2在性信息素的识别和结合中扮演主要角色。触角电位EAG结果显示，雄蛾比雌蛾对4种性信息素成分反应更强烈；雄蛾对Z8-12：Ac反应最敏感，其次是E8-12：Ac和Z8-12：OH，对12：OH不反应或反应不敏感。5．本研究还克隆出梨小食心虫一个新的普通气味结合蛋白基因，命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363），该基因开放阅读框全长492bp，编码163个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为18.62kDa和4.93，呈酸性，具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达，成虫羽化后5d内，雌蛾GmolOBP3表达量随成虫日龄而增加，但雄蛾羽化后第5dGmolOBP3表达量显著降低。荧光结合实验发现，GmolOBP3与E8-12：Ac和12：OH不结合，而与Z8-12：Ac和Z8-12：OH结合，但结合力较弱，结合常数分别为83.00μmol/L和103.70μmol/L。与16种寄主挥发物结合能力也不强，最大结合常数是与β-紫罗酮的结合，仅为49.36μmol/L。由此推断，GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。
【作者】宋月芹；
【导师】仵均祥；
【作者基本信息】西北农林科技大学，农业昆虫与害虫防治，2014，博士
【关键词】梨小食心虫；感受器；气味结合蛋白；原核表达；荧光竞争结合实验；触角电位；

【参考文献】
[1]梅念,石东源,谢俊,段献忠.基于编码理论的电网故障诊断及监测信号校正[J].电力系统自动化,2007,12:68-72.
[2]张晶晶.基于碳纳米管的肿瘤细胞电化学传感及凋亡研究[D].南京大学,2010.
[3]朱立新.射孔参数优化调整喇嘛甸油田注采剖面技术研究[D].东北石油大学,石油与天然气工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]何一群.活性碳纤维SBBR对畜禽养殖废水脱氮除磷研究[D].北京化工大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[5]蒋元涛.基于SWOT的智能型动态战略决策支持系统研究[D].华中科技大学,2004.
[6]朱红.基于人才认知的数据挖掘研究[D].昆明理工大学,2002.
[7]刘瑶.“渝派”历史文献纪录片创作论[D].西南大学,电影学,2013,硕士.
[8]木仁,马占新.决策单元特殊关系的挖掘与建立[J].控制与决策,2015,02:335-342.
[9]王炜.旅游景区企业人力资源开发管理模式创新研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[10]张严龙.中国邮政储蓄银行信贷业务发展研究[D].兰州理工大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[11]李迎迎,孟郁洁,夏兰芳,陈倩倩,李月,戚晓鹏.高速公路对居民健康影响的研究进展[J].环境与健康杂志,2014,01:80-83.
[12]侯爽.最终控制人、外部制度环境影响民营上市公司的路径和经济结果[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[13]俞霞.黄芩茎叶总黄酮对高糖诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及其机制的研究[D].扬州大学,中西医结合,2012,硕士.
[14]蒲激玲.高等学校社会服务职能履行问题研究[D].西南大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[15]韩清华.苯制备低维碳基纳米结构及其与磁性原子相互作用的研究[D].中国科学技术大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[16]朱可嘉.现代安全技术在网上证券交易系统中的应用[D].南京理工大学,电子与通讯工程,2012,硕士.
[17]郑思华.数据挖掘在移动大客户流失预测中的应用[D].南京理工大学,2004.
[18]崔立.活性炭材料的修饰及对超级电池性能影响的研究[D].哈尔滨工业大学,2012.
[19]董砚,潘洪瑞,王睿,孙鹤旭.基于PLC的闪光焊机控制系统[J].冶金自动化,2009,05:47-50.
[20]郭玮.电子书包学科教学App的设计与实现[D].华东师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[21]汤骏,龚水水,柯福佑,光善仪,徐洪耀.碳纤维结构表征及其电化学性能研究[J].山东化工,2014,12:52-55.
[22]沈国栋,蔡建峰,张力,赵列兰.我国银行兼并与收购动机的实证研究[J].重庆工商大学学报(社会科学版),2014,06:42-49.
[23]禚敬茹.论诉讼诈骗行为的刑法规制[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[24]段星梅.基于二元结构背景下的县域城镇化发展研究[D].西北大学,西方经济学,2013,硕士.
[25]郭婕妤.SJY公司薪酬管理体系优化设计[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[26]张伟波.船舶3D分舱设计技术研究[D].大连海事大学,船舶与海洋结构物设计制造,2013,硕士.
[27]付丽莎.文化产业项目后评价研究[D].西安建筑科技大学,行政管理,2013,硕士.
[28]王璐.数据在新闻生产中的运用研究[D].河北大学,新闻与传播,2014,硕士.
[29]刘哲.基于旅行绘本的品牌设计应用研究[D].首都师范大学,美术,2014,硕士.
[30]苏飞.社会工作视野下青少年网络成瘾问题的研究[D].广西师范大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[31]陈谋,姜长生,邹庆元,吴庆宪.数据链指挥下的战斗机H_∞飞行控制器设计[J].自动化学报,2008,02:211-214.
[32]寇锦.数控机床误差辨识与诊断新方法研究[D].大连理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[33]田媛.中小学教材的数字化交互学习方式的开发与设计研究[D].湖北工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[34]曾绍华.基于LonWorks网络的上位机智能模糊监控系统构建技术研究[D].西南农业大学,2004.
[35]康鑫.慢性阻塞性肺疾病频发急性加重表型患者的中医证候特征研究[D].北京中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[36]刘大松.草鱼肉在微冻和冰藏保鲜中的品质变化及其机理[D].江南大学,食品科学,2012,硕士.
[37]金秀莲.中医“治未病”健康工程项目管理研究[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[38]翟红秀.5-（2-呋喃基或噻吩基）-4-硫-（2’-脱氧）尿苷合成及生物活性的研究[D].大连大学,有机化学,2014,硕士.
[39]房巨强.三维打印快速成形机理及其加工质量控制技术研究[D].东北大学,机械制造及其自动化,2010,硕士.
[40]王猛.家蚕氨肽酶N基因和碱性磷酸酶基因在中肠组织的表达分析[D].江苏科技大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[41]鲁敏.生态农业观光园规划设计[D].湖北大学,人文地理学,2011,硕士.
[42]贺立.华信通信公司客服管理信息系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[43]董一眉.农产品供应链质量安全的源头治理研究[D].江南大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[44]徐溢.集成生化低电压芯片电泳系统的基础理论及关键技术研究[D].重庆大学,2006.
[45]余世策,蒋建群,楼文娟,孙炳楠.大型回流边界层风洞研制[J].实验技术与管理,2014,03:51-54.
[46]张立琴.贵州罗甸透闪石玉的成分、结构及谱学特征研究[D].中国地质大学（北京）,宝石学,2013,硕士.
[47]蒋建东,花京华,李鲁霞.分布式光伏阵列重构拓扑及控制方法[J].机电工程,2013,03:343-348+353.
[48]侯鹏翔,刘畅,成会明.气相刻蚀选择性制备单一导电属性单壁碳纳米管[J].科学通报,2014,33:3280-3292.
[49]文军.改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的作用研究[D].南方医科大学,外科学,2014,博士.
[50]于强强,韩学山,郝广涛,张玉敏,张学清.考虑储备阈值的电动汽车换电需求分析[J].电力系统自动化,2014,10:49-54.