苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路研究
【摘要】疯草(locoweed)是豆科黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物的总称,在世界范围内广泛分布,动物采食后会导致严重的疯草病(locoism),极大地危害了草原畜牧业的发展。研究发现,疯草中的主要有毒成分是苦马豆素(1,2,8-trihyroxyindolizidine,swainsonine,SW)。妊娠山羊采食含有SW的植物后,引起胎盘发育迟缓、充血,胎盘滋养层细胞发生病变,并最终导致妊娠山羊流产。胎盘滋养层细胞在胚胎发育和胎盘形成过程中发挥着重要作用,一些病原和有毒物质引起的胎盘滋养层细胞凋亡是导致滋养层细胞病变和动物流产的主要原因。本研究以山羊胎盘滋养层细胞为研究模型,检测SW对山羊胎盘滋养层细胞的细胞周期和侵袭特性的影响,探索SW诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路,以期揭示SW损伤妊娠山羊胎盘并导致山羊流产的分子机制。研究取得以下结果。1.采集妊娠45~60d的萨能奶山羊胎盘组织,无菌条件下分离、纯化得到了原代山羊胎盘滋养层细胞。原代山羊胎盘滋养层细胞贴壁后呈不规则多边形,细胞长满单层后呈典型的铺路石状,具有接触抑制的生长特点。纯化得到的细胞大多为单核滋养层细胞,同时含有少量的双核滋养层细胞。将携带有人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因的pCI-neo-hTERT质粒导入第3代原代山羊胎盘滋养层细胞,经G418筛选14d后,挑取阳性细胞扩大培养。转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞呈不规则多边形和典型的铺路石状、具有接触抑制的生长特点。通过免疫荧光检测发现,原代山羊胎盘滋养层细胞和转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞特异性表达滋养层细胞标志分子—细胞角蛋白7(cytokeratin7,CK-7)。RT-PCR、Westrenblot和TRAP-ELISA检测结果显示,hTERT基因在转染后山羊胎盘滋养层细胞内能稳定表达,并且保持着相对较高的端粒酶活性;通过绘制细胞生长曲线发现,转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞的群体倍增时间比第3代原代山羊胎盘滋养层细胞群体倍增时间缩短将近1h。结果表明,转染后,hTERT基因稳定整合于山羊胎盘滋养层细胞基因组,在细胞中稳定表达并保持着相对较高的端粒酶活性,从而使细胞永生化。2.RT-PCR检测结果表明,转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞和原代山羊胎盘滋养层细胞均表达上皮细胞特异性黏附分子E-cadherin;免疫荧光和RT-PCR检测显示,转染后第50代和原代山羊胎盘滋养层细胞能够表达与滋养层细胞侵袭特性相关的波形蛋白(vimentin,Vim)分子和非经典MHC-ⅠmRNA,Transwell细胞侵袭试验进一步证实了转染后的山羊胎盘滋养层细胞保留了原代滋养层细胞的侵袭特性;放射免疫检测发现,转染后的山羊胎盘滋养层细胞具有原代细胞分泌绒毛膜促性腺激素β亚基(CG-β)和胎盘催乳素(PL)的功能,并且差异不显著。软琼脂克隆形成试验和裸鼠致瘤性试验结果表明,转染后的山羊胎盘滋养层细胞没有发生肿瘤转化。研究结果表明,永生化的山羊胎盘滋养细胞保留了原代滋养层细胞的关键生物学特性和功能,并且没有获得肿瘤转化特性,可以作为研究山羊胎盘滋养层细胞功能和病原、毒物与滋养层细胞相互作用的细胞模型。3.MTT试验和台盼蓝排斥试验检测发现,山羊胎盘滋养层细胞分别经0、0.4、0.8、1.2μg/mL的SW处理24h后,细胞活性没有发生明显变化,1.6μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h后,细胞活性显著降低。山羊胎盘滋养层细胞分别经0、0.4、0.8、1.2和1.6μg/mL的SW处理24h后,流式细胞术检测结果表明,浓度大于0.8μg/mL的SW显著地将细胞周期阻滞在G0/G1期,Westernblot检测结果显示,细胞周期调控蛋白cyclinE,cyclinD1和CDK2的表达量随SW浓度升高而下降;细胞黏附试验发现,浓度大于0.8μg/mL的SW显著抑制了山羊胎盘滋养层细胞的黏附能力,并且呈一定的剂量依赖性,Westernblot检测结果表明,滋养层细胞中与细胞黏附相关的整合素αvβ3分子表达量降低;Transwell试验结果表明,浓度大于0.8μg/mL的SW显著抑制了山羊胎盘滋养层细胞的迁移和侵袭能力,并且呈一定的剂量依赖性,Westernblot检测发现,山羊胎盘滋养层细胞中MMP-2表达量随着SW剂量的升高而逐渐降低,MT1-MMP/TIMP-2的比值随着SW剂量的升高而逐渐降低。4.MTT试验结果表明,1.6μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h或2.4μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞12h后,细胞活性显著降低,并且呈一定的时间和剂量依赖性。AO/EB染色结果显示,SW能够引起山羊胎盘滋养层细胞染色质凝聚、细胞核固缩和裂解等典型的细胞凋亡表征;琼脂糖凝胶电泳结果显示,2.4μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h后,细胞染色体DNA被切断成180~200bp整数倍大小的片段,呈典型的梯形条带;AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测显示,SW诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡呈现出一定的时间和剂量依赖性关系。结果表明,SW是通过诱导细胞凋亡来抑制山羊胎盘滋养层细胞活性的。5.Caspase活性检测和Westernblot检测发现,SW处理能够激活山羊胎盘滋养层细胞中的Caspase-9和Caspase-3,引起PARP降解,而Caspase-8的活性没有发生显著变化;Caspase-9和Caspase-3的特异性抑制剂均能够显著抑制SW引起的细胞凋亡,结果表明,SW诱导的细胞凋亡依赖于Caspase-9/-3的级联活化。Westernblot检测显示,SW处理对山羊胎盘滋养层细胞中Fas,FasL的表达量没有明显影响,但SW能够上调山羊胎盘滋养层细胞中促凋亡蛋白Bax,下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,导致Bax/Bcl-2的比值升高,SW还能够促进Bax向线粒体转位,导致线粒体内Cytochromec释放到细胞浆。此外,TUNEL染色结果显示,SW能够选择性的诱导山羊胎盘组织中滋养层细胞凋亡,而对胎盘组织中的其他细胞几乎没有影响。结果表明,SW是通过激活由线粒体介导的、依赖于Caspase-9/-3活化的凋亡途径来诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡。本研究建立了一株保持有原代山羊胎盘滋养层细胞关键生物学特性和功能的永生化细胞系,阐明了低浓度SW能够阻滞山羊胎盘滋养层细胞的细胞周期、抑制细胞的黏附、迁移和侵袭能力,而高浓度SW能够通过激活依赖于Caspase-9/-3活化的线粒体通路来诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡。研究结果揭示了SW引起妊娠山羊流产的分子机制,为解释疯草引起的母畜生殖障碍提供了新的理论基础。
【作者】董峰;
【导师】童德文;
【作者基本信息】西北农林科技大学,基础兽医学,2014,博士
【关键词】苦马豆素;山羊胎盘滋养层细胞;永生化;细胞凋亡;信号通路;
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