猪和山羊多能性干细胞及其培养体系的研究

【摘要】多能性干细胞是一类具有自我更新能力和能够实现向内、中、外三个胚层分化的细胞。多能性干细胞在家畜如猪、牛、羊等动物中有广泛的应用价值，例如用于研究器官移植、人疾病模型以及生物药品的研制开发等，是具有重要研究意义的细胞材料。近年来，许多研究都尝试获得家畜多能性干细胞，然而这个过程中依然存在着很多困难和问题。如：获得的多能性干细胞不能在体外长时间稳定传代、多能性基因表达特征不统一、不能获得嵌合体动物或嵌合率低等。到目前为止依然没有公认的可供参考的家畜多能性干细胞系，没有适合多能性干细胞的培养体系可能是最主要的问题之一。本研究主要对猪和山羊的多能性细胞进行了研究。关于猪的多能性细胞研究，我们首先以猪胚胎生殖细胞（EGCs）为参考，通过添加各种细胞因子和化学小分子来优化培养条件，初步确定了适合猪多能性干细胞的培养体系。并在此基础上，诱导获得了猪诱导多能性干细胞（iPSCs）。在对获得的猪iPSCs进行鉴定确定其多能性之后，我们探讨了培养条件中SB431542和BMP4在诱导piPSCs形成过程中的作用机制。此外，我们通过mRNA和miRNA测序对piPSCs的转录组特性进行了分析。关于山羊的多能性细胞的研究，我们尝试用不同的培养条件分离山羊ES样细胞，并在此培养条件基础上进行了山羊iPSCs诱导。同时在此过程中构建了用于监控细胞多能性的报告系统。具体结果如下：1.猪胚胎生殖细胞（EGCs）的分离培养通过改变饲养层细胞的类型以及在培养基中添加各种小分子化合物来筛选适合猪EGCs的培养条件。在基础培养基（DMEM+15%FBS+10ng/mLhLIF+10ng/mLFGF2+40ng/mLhSCF，详见3.1.1.2）中添加PD0325901、CHIR99021和SB431542三种小分子化合物（详见3.1.1.2），通过统计碱性磷酸酶（AP）染色阳性的EGCs克隆数目来确定最适的培养条件。之后，在此培养条件的基础上，比较了小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）、猪胎儿成纤维细胞（PEF）及中肾区基质细胞饲养层对猪EGCs的影响，确定了MEF饲养层为最适合的饲养层。2.猪诱导多能性干细胞（piPSCs）的建系及不同培养条件对细胞重编程的影响利用人的四因子OSKM（OCT4、SOX2、KLF4及C-MYC）对PEF进行诱导，并且在猪EGCs培养条件的基础上对猪iPSCs的培养条件进行优化，确定了最适合的培养条件，在此条件下获得了两株能在体外稳定传代的piPSCs系，将其命名为LFB2i-piPSC1和LFB2i-piPSC2。获得的两株piPSCs和人的胚胎干细胞（hESCs）类似，具有高的核质比并且表现出AP阳性。对这两株piPSCs进行分子及细胞生物学鉴定，结果表明该细胞具有外源基因插入，且外源基因的表达沉默；细胞表达内源的OCT4、SOX2、NANOG、ESRRB等多能性因子，和SSEA1、Tra-1-60等干细胞表面标记；体内外分化实验均表明其具有向三个胚层分化的能力。通过流式细胞技术检测iPSCs诱导第8天上皮细胞标记E-cadherin阳性细胞数，从而将LFB2i-piPSCs培养基中的添加成分LIF、FGF2、CHIR99021、SB431542和BMP4单独或组合后对猪诱导多能性干细胞形成初期间充质向上皮转化（MesenchymaltoEpithelial,MET）的作用进行了系统的筛选。并且通过RealtimeRT-PCR和WesternBlotting共同证明SB431542和BMP4联合能够加速MET的发生。另外，对重编程过程中细胞增殖的检测发现SB431542和BMP4联合能够促进细胞的增殖。3.猪诱导多能性干细胞的转录组分析对LFB2i-piPSCs进行了mRNA和sRNA测序，并且和PEF、FGF2-piPSCs（能够产生嵌合体动物的piPSCs）数据进行了比较。mRNA-seq结果显示LFB2i-piPSCs表达高水平的SOX2,L-MYC,ESRRB等基因以及相对低水平的POU5F1(OCT4),KLF4和NANOG基因。miRNAs分析表明LFB2i-piPSCs高表达与多能性相关的miR-17-92、miR-302b-367、miR-106a-363、miR-290家族中的miRNAs，低表达let-7家族中的miRNAs。4.山羊NANOG启动子报告载体的构建和细胞多能性监控首先尝试用不同的培养条件进行了山羊ES样细胞的分离和iPS样细胞的诱导，并对获得的细胞进行了初步鉴定。之后克隆并验证了山羊NANOG近端启动子，将其与EGFP相连接构建了报告载体。通过细胞转染和显微注射证明该报告载体具备表达功能和组织特异性。将该载体稳定转染到山羊成纤维细胞中作为重编程的受体细胞，从而对山羊体细胞重编程过程进行监控。同时将该报告载体显微注射到山羊胚胎中用于监控山羊早期胚胎的发育进程。
【作者】郭燕杰；
【导师】王华岩；
【作者基本信息】西北农林科技大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】猪；山羊；NANOG；多能性干细胞；MET；转录组；

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