陆地棉开花促进因子基因GhFPF1的克隆、表达及功能分析

【摘要】棉花是我国重要的经济作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位，但是我国的基本国情是人多地少，粮棉矛盾突出。所以短季棉的选育与推广是解决我国粮棉争地、保证粮食安全的重要途径。开花促进因子基因FLOWERINGPROMOTINGFACTOR1(FPF1)于1997年从拟南芥中克隆出来，经光周期诱导后，它在茎尖分生组织中的表达量迅速上调，对拟南芥开花时间起到正调控的作用，后来在其他作物如烟草中也证实其促进开花这一功能，但对于其调控开花时间的信号通路，目前还不清楚。本研究利用已经测序完成的雷蒙德氏棉和亚洲棉数据库为基础，在陆地棉中获得了FPF1基因的同源序列，对它们的表达模式进行分析筛选出候选基因，并对其功能进行了更加深入的研究，具体结果如下：1、以拟南芥中FPF1基因为参考序列在二倍体雷蒙德氏棉和亚洲棉数据库中分别比对得到六条蛋白质相似度比较高的序列。将这些序列于核酸和氨基酸水平在两个二倍体棉种间进行对比分析发现：六个基因的核酸序列均有不同程度的差异，相似度在84%-99%之间；有两个基因的氨基酸序列在两个物种中是完全相同的；其中五个基因含有较高的同义突变，这可能是由于不同物种分子水平上进化的差异性以及保守型决定的。2、从陆地棉中棉所36中克隆到FPF1的同源基因六条，分别命名为GhFPF1，GhFLP1，GhFLP2，GhFLP3，GhFLP4和GhFLP5，发现该基因家族基因片段均比较小，且不含内含子。研究各基因在陆地棉各组织器官中的表达模式发现，GhFPF1基因家族成员呈现出明显的表达特异性，主要在根和茎尖中表达。利用早熟棉中棉所36和遗传标准系TM-1筛选出候选基因GhFPF1基因，暗示其可能参与短季棉开花时间的调控。3、构建了融合表达载体pBI121-GFP-GhFPF1，采用基因枪轰击洋葱表皮的研究发现GhFPF1蛋白在细胞膜和核内均有表达。进一步通过5’-RACE及3’-RACE策略，扩增出了GhFPF1的全长转录本为701bp，包含56bp5’-UTR，315bp3’-UTR和330bpORF区域。分析启动子区域发现其主要包含两大类顺式元件，光反应元件和植物胁迫相关的一些元件。外源激素处理试验表明GhFPF1能够响应SA和JA的处理，暗示GhFPF1可能参与植物的防御反应。4、将GhFPF1基因构建植物过表达载体分别转化拟南芥和棉花，分别获得了7个转基因拟南芥株系和9个转基因棉花株系。结果证实转基因拟南芥各株系的开花时间平均比野生型拟南芥提前5.4天，莲座叶和茎生叶的数目也减少。通过对比分析拟南芥内源开花时间相关基因在野生型和转基因中的表达量变化，推测GhFPF1在拟南芥中过表达促进开花很可能依赖于AtAP1和AtFLC。5、最新研究发现GhFPF1基因除了具有调节植物生育期、开花时间、植物叶数之外，转基因拟南芥与野生型相比，下胚轴伸长，叶柄加长，叶绿素的含量降低，AtPHYB基因的表达量在转基因拟南芥中也明显降低，我们推论GhFPF1基因很可能参与调控植物的“避荫”反应。6、将该基因采用农杆菌介导的方法过表达转化棉花，通过基因组和mRNA水平的检测共获得了9个T0代转基因株系，目前个别株系已收获T2种子，要想揭开GhFPF1在调控植物开花和“避荫”反应过程中所涉及的信号通路，还需进一步研究。
【作者】王小艳；
【导师】喻树迅；
【作者基本信息】西北农林科技大学，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】棉花；开花时间；FPF1；遗传转化；避荫反应；

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