鸡胚发育过程N-Cadherin在中枢神经系统中的表达模式和功能调控

【摘要】胚胎发育过程中枢神经系统的发育存在大量神经元的形成和迁移，而神经元形成和迁移受到众多分子的调控，其中细胞粘附分子钙粘蛋白家族成员发挥重要作用。神经钙粘蛋白(N-Cadherin)最初在鸡胚神经管中被发现，是钙粘蛋白家族成员之一，在中枢神经系统发育过程中扮演重要角色。在中枢神经系统形成过程新生细胞向神经元分化或新生神经元迁移异常会导致神经系统发育异常，因此，研究导致神经元分化或迁移异常的分子机制成为发育神经生物学研究的热点。本研究以N-Cadherin为关键分子，通过活体电转基因技术，实现鸡胚发育过程N-Cadherin在中枢神经系统中的异常表达，分析其异常表达后对轴突形成和神经元迁移的影响，进一步探讨N-Cadherin在神经系统发育过程中的功能调控。研究结果如下：1.成功建立了鸡胚的带壳培养和去壳培养方法，同时也建立和优化了活体电转基因技术，实现了目的基因在脊髓和视顶盖中的表达，该方法适用于脊髓最佳转染时间在E2.5-E3(HHstage18-24)，视顶盖最佳转染时间在E5(HHstage27)，脊髓转染阳性表达率达到54.5%，视顶盖转染阳性表达率达到60%，完全可以达到实验研究的需要。2.对pCAGGS-GFP、pEGFP和pCL-GFP三种质粒启动GFP表达强度进行分析，其所用启动子分别为CAG、CMV和SV40，在鸡胚中启动GFP转录表达强度存在明显差别，其中CAG启动子的GFP表达最强，其次是CMV，而最弱的则是SV40启动子，要实现目的基因在鸡胚中的高表达，CAG启动子为最佳选择；pCAGGS-GFP转染鸡胚后，GFP的表达对鸡胚的发育和相关蛋白α-SMA(α-smoothmuscleactin)和NF(neurofilament)的表达不会带来影响，在鸡胚发育过程GFP可以作为报告基因。3.体外实验中脂质体转染293T细胞pCAGGS-GFP阳性表达率为67.8％，在所设计的3条shRNA干扰靶序列中，通过Westernblot筛选出一个干扰效果最优的载体，其干扰靶序列为GCAAATGAAGGTGAAGCTAAC，荧光免疫组化表明pCAGGS-N-Cadherin超表达载体的阳性表达率为44.6％；N-Cadherin超表达后，细胞内相关蛋白的表达受到不同程度的影响，更为明显的是连环蛋白(catenin)的变化，特别是β-catenin表达量和表达部位发生不同的改变，当N-Cadherin高表达时β-catenin的表达量明显增加，干扰载体和超表达载体共转染组中β-catenin表达量有所下调，并观察到β-catenin向细胞核聚集，因此，该结果提示N-Cadherin与β-catenin之间存在密切的联系，在后期实验中将β-catenin作为活体内重要指标进行检测。4.在进行活体内实验之前对N-Cadherin在脊髓和视顶盖中的表达模式进行了研究，同时分析了NF与N-Cadherin共表达的模式，在鸡胚发育过程N-Cadherin的表达呈现时空性的变化，在胚胎发育早期脊髓(E3)时和视顶盖(E4)时便开始表达，在胚胎发育的E6-E8时达到最高，E10之后降低，到胚胎发育后期维持在一个较低的表达水平，NF的表达模式和N-Cadherin具有相似性，在众多的结构中呈共表达的模式，但是NF主要在神经丝中表达，在明确N-Cadherin的表达模式基础上开展了鸡胚发育过程脊髓和视顶盖中的异常表达实验研究。5.鸡胚发育过程脊髓中N-Cadherin的超表达或表达下调都会影响脊髓轴突的联合投射，正常对照中脊髓轴突的投射有两种，其一为基板中央纵向投射(mediallongitudinalcommissuralprojection,MLC)，投射是沿基板纵向分布；其二为对侧脊髓中间纵向投射(intermediatelongitudinalcommissuralprojection,ILC)，投射是远离基板位于对侧脊髓中间纵向分布。N-Cadherin超表达的情况下主要观察到MLC，而ILC现象不明显；在下调表达的情况下MLC和ILC都消失，而β-catenin下调后的表现型和N-Cadherin下调的结果相似，在N-Cadherin和β-catenin共同下调的条件下结果更为明显。说明了N-Cadherin可能是通过β-catenin信号通路进而对脊髓轴突的联合投射产生抑制。6.在鸡胚发育过程中，视顶盖N-Cadherin超表达或抑制表达都会导致被转染的细胞迁移受到抑制，大量细胞滞留在NE(Neuroepithelium,NE)层。在超表达的条件下β-catenin的表达增强，在下调表达条件下β-catenin表达减弱。综上所述，本研究系统分析了鸡胚发育过程N-Cadherin在中枢神经系统中的表达模式，建立了一套基于活体电转基因技术鸡胚模型中枢神经系统中基因功能研究的方法，首次证明N-Cadherin异常表达导致脊髓轴突投射障碍，对神经元的迁移具有抑制作用，为N-Cadherin在活体内功能的研究提供了新的方法和参考。
【作者】杨慈清；
【导师】赵善廷；
【作者基本信息】西北农林科技大学，神经生物学，2014，博士
【关键词】N-Cadherin；脊髓；视顶盖；表达模式；功能调控；

【参考文献】
[1]于景.人防应急指挥调度系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2009,硕士.
[2]陈莉,钱伟,吴建乐.基于相关集合的事务数据库挖掘[J].广西工学院学报,2004,01:35-39.
[3]田苗苗.《新疆日报》（汉文版）“三农”报道研究[D].新疆大学,新闻学,2013,硕士.
[4]赵博.从清代禁毁小说看法律对文学的规制[D].中国政法大学,法学理论,2013,硕士.
[5]鲁绍基,苑琪.用计数器/定时器触发晶闸管[J].冶金自动化,1984,05:35-39.
[6]胡浩.车辆碰撞事故中颅脑损伤建模与伤害评价研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[7]刘宝江.忠宝钨矿外围矽卡岩型钨矿勘查技术方法组合研究[D].新疆大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[8]张伟花.热处理对石墨烯薄膜结构及电阻性能的影响[D].太原理工大学,2013.
[9]武茵.教育性戏剧视野内的教育剧场研究[D].上海戏剧学院,艺术学,2013,硕士.
[10]王豪.带转换层的高层建筑结构抗震研究[D].重庆交通大学,结构工程,2012,硕士.
[11]杨亚楠.深过冷Fe-B-Si共晶合金可控制备及组织演化机理[D].中国矿业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[12]国蕊.基于“长春婴儿”网络突发事件的舆情传播研究[D].哈尔滨工业大学,行政管理,2014,硕士.
[13]梁顺军,梁顺彬.高陡背斜地震剖面高点偏离问题分析及其校正[J].石油地球物理勘探,2001,01:105-114+133.
[14]徐素国.岩盐矿床油气储库建造的基础研究[D].太原理工大学,工程力学,2004,硕士.
[15]吴飞宏.香蕉枯萎病菌4号小种一个致病相关基因克隆及其功能的初步研究[D].海南大学,分子植物病理学,2012,硕士.
[16]王树慧.甘谷驿油田顾屯探区长6储层裂缝研究[D].西安石油大学,矿产普查与勘探（专业学位）,2012,硕士.
[17]吴海滨.闭环供应链混合回收渠道模型及协调研究[D].重庆大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[18]李蔓丽.中西设计文化探源[D].武汉理工大学,设计艺术学,2004,硕士.
[19]胡海燕.转双抗虫基因741杨林土壤生物群落研究[D].河北农业大学,森林保护,2004,硕士.
[20]李春竹.埋地管道阴极保护监测探头及防护层质量评价的研究[D].天津大学,应用化学,2004,硕士.
[21]杨祝辉.200MW汽轮发电机烧瓦原因分析[J].发电设备.1989(01)
[22]邱萍.二语习得者道歉言语行为研究[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[23]亢海娟.Gd含量对Mg-Gd-Y-Sm-Zr合金组织和性能的影响[D].河南科技大学,材料学,2013,硕士.
[24]杨玉森.嵌入式linux下媒体播放器关键技术的研究与应用[D].华中科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[25]李继伟.新型生物芯片透析器的构建及评估[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[26]龙艳.体外培养人创面肉芽组织成纤维细胞生物学特性研究[D].遵义医学院,整形外科,2013,硕士.
[27]王金水.交互式特征定位过程及支持技术研究[D].复旦大学,计算机软件与理论,2013,博士.
[28]刘晓叶.论保定作家群对“十七年”电影创作的影响[D].河北大学,广播电视艺术学,2014,硕士.
[29]秦昉.水泥混凝土投料搅拌工艺及其影响试验研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[30]郭玲.戏剧《卖花女》对话中的会话含义分析[D].内蒙古师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[31]闾仁.罂粟碱灌洗肠腔预防直肠癌前切除术后吻合口瘘的临床研究[D].福建中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2014,硕士.
[32]王东,彭立民,傅峰,王军锋,朱广勇.柳杉木材吸声性能的研究[J].中南林业科技大学学报,2014,10:137-140.
[33]方国跃.不同硒源对肉仔鸡生产性能的影响[D].湖南农业大学,动物营养与饲料科学,2003,硕士.
[34]李杰.连铸坯凝固组织的模拟[D].东北大学,钢铁冶金,2010,硕士.
[35]宋文乐.电力系统智能协同方式计算系统的设计[D].北京交通大学,电气工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]王淑怡.丝瓜络炭磺酸催化剂的制备及其应用研究[D].华东交通大学,2014.
[37]万良勇,刘开云.公路隧道交通量预测的粒子群高斯过程耦合模型[J].北京交通大学学报,2015,01:33-39.
[38]廖本强.Er：YAG激光牙科治疗仪设计与仿真[D].合肥工业大学,固体电子器件,2004,硕士.
[39]王晓丽,胡心怡,申继亮.农村留守儿童友谊质量与孤独感、抑郁的关系研究[J].中国临床心理学杂志,2011,02:252-254.
[40]李宇松.建设工程项目风险管理研究与实践[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[41]甘洋洋.径轴向环件轧制工艺优化与CAPP系统开发[D].山东建筑大学,材料加工工程,2013,硕士.
[42]辛冰雪.库的谱密度对两量子位纠缠演化特性的影响[D].华中师范大学,光学,2013,硕士.
[43]张曼露.非金属原子掺杂对石墨烯气体吸附特性影响的理论研究[D].华东理工大学,2013.
[44]李振志.杜仲籽提取物对去势大鼠骨质疏松的作用机制研究[D].西北大学,中药学,2014,硕士.
[45]胡国栋.我国环境犯罪立法完善研究[D].安徽大学,法律,2013,硕士.
[46]朱芳.文科硕士生学习性科研的现状研究[D].湖南师范大学,高等教育学,2013,硕士.
[47]王文博.从词在唇边现象看中国英语学习者英语词汇的提取过程[D].中国人民解放军外国语学院,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[48]陈文凤.智能家居远程监控系统的研究与设计[D].广东工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[49]魏晓静.EVA在电子信息企业绩效评价中的应用研究[D].西安科技大学,工业工程,2014,硕士.
[50]曹英志.海域资源配置方法研究[D].中国海洋大学,海洋资源与权益综合管理,2014,博士.