绒山羊次级毛囊周期性变化相关microRNA的鉴定及miR-125b在毛乳头细胞中的功能研究
【摘要】毛囊是皮肤的附属器官，由20多种细胞组成，主要分为上皮细胞和真皮细胞两类，上皮细胞和真皮细胞的相互作用是诱导毛囊形成和周期性变化的主要原因。绒山羊的毛囊分为初级毛囊和次级毛囊，其产物分别是粗毛和细绒。粗毛和细绒纤维直径差异极大，且用途及经济价值显著不同。初级毛囊的周期性变化不明显，而次级毛囊在一年中经历生长期、退行期和休止期三个阶段，具有显著的周期性、时序性。miRNA是一种大小为19-25nt的非编码核苷酸单链小分子RNA，通过与靶基因结合位点的特异性结合，抑制靶基因翻译或降解靶mRNA来发挥重要的调节作用。研究表明miRNA参与机体的各种调节途径，包括胚胎发育、器官形成、细胞分化增殖和凋亡、细胞周期的转换、肌肉和脂肪代谢等。本研究利用高通量测序、细胞培养、细胞转染、基因克隆及基因表达分析等实验技术结合生物信息学分析，对陕北白绒山羊次级毛囊周期性变化相关的miRNA进行鉴定和差异性分析，继而对表达差异性显著的miR-125b进行了初步的功能研究，取得以下主要结果：1.构建了绒山羊次级毛囊生长期、退行期和休止期皮肤组织的小RNA文库，经Solexa测序后得到纯净读数分别为15,997,828、18,111,912和27,016,012。在这三个文库中小RNA的长度分布一致，长度在22nt的小RNA最多。2.在绒山羊次级毛囊生长期、退行期和休止期皮肤中分别鉴定了352个、372个和374个保守miRNA，共399个miRNA。其中在3个时期都表达有326个miRNA，在生长期、退行期和休止期特异表达分别有3个、12个和11个miRNA。3个时期样品的miRNA都是序列长为22nt的表达含量最高，且首位碱基以尿嘧啶（Uracil，U）为主。而且3个时期共预测得到172个新miRNA，其中在3个时期都表达有36个，在生长期、退行期和休止期特异表达分别有23个、29个和44个。3.预测的靶基因GO富集分析显示，9981个靶基因中79.4%的靶基因参与细胞过程，55.8%的靶基因参与代谢过程，47.2%的基因参与生物调节过程。KEGG生物学通路注释表明，10,563个预测靶基因注释到278项生物功能，其中1212个靶基因注释到代谢途径，占总数的11.49%，其次是MAPK信号通路（3.01%）、内吞作用（2.68%）、焦点粘连（2.66%）和肌动蛋白细胞骨架调节（2.45%）。4.构建miR-125b的组织差异表达谱，结果显示miR-125b在绒山羊皮肤和大脑组织中表达量最高，在肝和脾中表达量最低，具有组织特异表达性。5.运用TargetScan软件对miR-125b进行靶基因预测，共得到2881个靶基因，对比文献中报道的毛囊周期性变化相关的6个信号通路（Wnt，TGF-β，Notch，SHH，MAPK和Jak-STAT）及相关的基因，得到FGF1、FGF5、TGF-β1、TGF-β3、TNF-α5个候选靶基因。通过扩增得到山羊FGF1、FGF5、TGFβ-1、TGFβ-3和TNF-α预测靶位点序列，与牛的序列进行比对，发现FGF1基因靶位点和预测所用牛的序列出现突变。将FGF5、TGFβ-1、TGFβ-3和TNF-α作为miR-125b靶基因进行双荧光素酶报告基因检测验证，结果显示miR-125bmimics不作用于预测的TGFβ-1基因的靶位点，虽然能够抑制野生型FGF5，TGFβ-3和TNF-α基因的靶位点报告载体的荧光素酶活性，但是靶基因结合位点突变后，只有FGF5被抑制的荧光素酶活性得到恢复。表明FGF5基因是miR-125b的靶基因，miR-125b能够靶向调节预测的FGF5基因的靶位点。6.体外培养绒山羊次级毛囊毛乳头细胞，观察发现毛乳头细胞呈凝集性生长，采用免疫荧光检测发现α-SMA、versican和CD133呈阳性表达，表明成功获得绒山羊次级毛囊毛乳头细胞，这为在细胞水平上研究毛囊发育相关基因的功能奠定了基础。7.构建pri-miR-125b的腺病毒载体，经包装、扩繁后，采用TCD50法测定病毒滴度，pAd-miR-125b的滴度为2.30×109pfu/mL，空病毒pAd-GFP的滴度为2.05×109pfu/mL，MOI为300时为次级毛囊毛乳头细胞最佳感染浓度。病毒感染毛乳头细胞72h后，与空白组相比，空病毒pAd-GFP组miR-125b表达量无变化，腺病毒pAd-miR-125b组中miR-125b的表达量提高了约2.6倍(p<0.05)。以pAd-GFP为对照，感染pAd-miR-125b的毛乳头细胞中FGF5（p<0.01）、IGF-1（p<0.01）、Shh（p<0.01）、TNF-α（p<0.01）、Msx2（p<0.01）、Lef-1（p<0.01）、FGF7（p<0.05）、β-catenin（p<0.01）的表达量均显著下调，BMP2（p<0.01）的表达量显著上调，BMP4、Noggin、TGF-β1和BDNF的表达量变化差异不显著。表明miR-125b通过抑制FGF5基因的表达对毛囊周期性变化相关基因具有一定调控作用。本研究在绒山羊次级毛囊周期性变化中共发现399个保守miRNA和197个新miRNA并对3个时期中miRNA的表达量进行了分析，进一步丰富了山羊miRNA数据库；获得的重组腺病毒pAd-miR-125b能在绒山羊次级毛囊毛乳头细胞中稳定表达miR-125b，同时miR-125b过表达影响毛囊周期性变化相关基因mRNA的表达水平。
【作者】袁超；
【导师】陈玉林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】绒山羊；高通量测序；miRNA；毛囊；周期性变化；
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