组蛋白甲基化酶ESET调控小鼠精原干细胞存活的机理研究

【摘要】精原干细胞（spermatogonialstemcells，SSCs）位于睾丸曲细精管的基底膜，是雄性动物体内特有的能够将遗传信息传递给子代的一类成体干细胞。SSCs可以通过自我更新来维持其数量的稳定，也可以分化并产生精子。SSCs的自我更新与分化受多种信号通路（Src通路、Smad通路等）及转录因子（PLZF，BCL6B等）的调节。目前对SSCs功能调控的研究多局限在对这些信号通路及相关蛋白功能等经典遗传学研究领域。对于SSCs表观遗传学调控的研究报道较少，而对于SSCs中组蛋白甲基化调控机制的研究还未见报道。组蛋白甲基化酶ESET（ERG-associatedproteinwithaSETdomain）能够催化组蛋白H3K9发生甲基化。ESET参与细胞核内异染色质的形成过程，在调节内源性反转座子DNA甲基化的形成与维持、神经细胞的发育、成骨细胞的形成等方面具有重要的作用。本研究利用RNA干扰、基因表达谱芯片、精原干细胞移植、染色质免疫共沉淀等技术对小鼠SSCs中组蛋白H3K9me3的分布及其甲基化酶ESET的功能与作用机制进行了研究。主要的研究结果如下：（1）检测了ESET在小鼠不同组织及不同发育阶段睾丸中的表达。发现ESET在睾丸组织中表达量最高；并且ESET及H3K9me3在睾丸组织中的整体水平随着小鼠日龄的增大而逐渐升高，二者共定位于SSCs中。（2）筛选出了对小鼠Eset基因具有干扰效果的shRNA序列，并构建干扰慢病毒载体。经包装得到的Eset干扰慢病毒滴度达到1.7×107CFU/ml。通过免疫磁珠分选获得了高纯度（91.5%）的小鼠SSCs，经Eset干扰慢病毒感染后（ESET-Knockdown,ESET-KD），其干扰效率达到68.3%。（3）分析了表达谱芯片中16611个基因的表达。相对于对照组，在ESET-KD组中表达量上调2倍以上的基因有2490个，占总数的15.0%；表达量下调2倍以上的基因有2425个，占总数的14.6%。GO分析结果表明ESET具有催化活性并与小鼠精原干细胞中蛋白及DNA的结合有关。而Pathway分析的结果进一步表明ESET影响P53等通路中若干种基因的表达，说明ESET可能与小鼠精原干细胞的凋亡过程有关。（4）研究了ESET在SSCs维持中的功能。在培养两周后，ESET-KD组的SSCs与对照组相比细胞数量显著下降。TUNEL染色结果表明ESET-KDSSCs中凋亡细胞的数量显著高于对照组。在ESET-KDSSCs中P53，Apaf1，Caspase9，Caspase3（P17）等的表达显著升高，Bcl2l1及XIAP的表达则显著降低，PARP蛋白被剪切。表明抑制ESET表达会诱发体外培养SSCs凋亡。同时，将SSCs移植到受体小鼠睾丸的曲细精管中，分析了受体小鼠的睾丸重量、正常精子发生的精细管比例、睾丸组织中的GFP和PLZF的表达量，发现移植ESET-KDSSCs受体小鼠的各项指标显著低于对照组。该体内试验结果表明ESET对于小鼠SSCs的存活是必需的。（5）研究了ESET调控SSCs存活的分子机理。ESET-ChIP试验表明ESET能够直接与Sohlh2、Nobox、Dazl、Foxn1、Cox4i2等基因的启动子结合。H3K9me3-ChIP试验发现ESET-KD组中上述5个基因启动子的H3K9me3水平显著低于对照组。ESET-siRNA单转染组与ESET-siRNA、Cox4i2-siRNA共转染组相比，后者Caspase9的表达水平显著降低，表明Cox4i2是ESET调控小鼠SSCs凋亡的下游靶基因。此外，蛋白质免疫共沉淀试验表明ESET能够与DNMT3A结合。在ESET-KD组，Cox4i2基因启动子的DNA甲基化水平明显低于对照组，表明ESET还能够通过影响其靶基因的DNA甲基化水平调节基因的转录。综上所述，本研究从表观遗传学角度研究了组蛋白H3K9me3及其甲基化酶ESET在小鼠SSCs中的功能及其调控机制。本研究是对SSCs经典遗传学研究的补充，为后续SSCs的表观调控研究提供了一种新思路。
【作者】安俊辉；
【导师】曾文先；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】精原干细胞；ESET；H3K9me3；RNA干扰；

【参考文献】
[1]张凛凛.墨家与亚里士多德逻辑思想比较研究[D].黑龙江大学,逻辑学,2013,硕士.
[2]邓长春.解决农村留守问题中的地方政府责任研究[D].华中师范大学,行政管理,2012,硕士.
[3]罗思.历史文化遗产的数字保护研究[D].武汉纺织大学,设计艺术学,2014,硕士.
[4]胡亦玺,丁伟斌,郭化林.资产全寿命周期管理:内在机理与全景式展现[J].财会月刊,2015,09:92-95.
[5]石晶,龚震宇,裘杭萍,张毓森.评测Web使用分析中会话识别的准确度[J].电子科技大学学报,2002,03:281-285.
[6]张云丽.高校合作开发中文图书采访平台的思考——以武汉大学和厦门大学图书馆为例[J].图书馆学研究,2014,07:48-51.
[7]于海峰.雷公藤多甙片合“IgA肾病方”对IgA肾病风湿内扰证的临床研究[D].浙江中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[8]姜婷婷.正畸牙齿移动过程中Smurf1在牙周组织中表达的动物实验研究[D].大连医科大学,口腔临床医学,2012,硕士.
[9]陈方华.房地产行业中的客户关系管理研究[D].华中科技大学,2004.
[10]高原.On Translation of Chinese Neologisms into English[D].山西大学,英语语言文学,2004,硕士.
[11]郑书伟.晏几道的人生悲剧[D].山东大学,中国古代文学,2013,硕士.
[12]王礼鑫.涠西南凹陷西南部河流于始新统流沙港组流一段时期的古河流量[D].中国地质大学（北京）,地下水科学与工程,2014,硕士.
[13]姚伟国.中铁宝桥集团薪酬体系改革研究与探索[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[14]王炜祺.基于石墨烯纳米材料双酚A传感器的研究[D].上海师范大学,2012.
[15]王斌.二叶式主动脉瓣合并升主动脉扩张危险因素及手术风险的回顾性研究[D].复旦大学,外科学（专业学位）,2013,博士.
[16]陈琳玲.我国企业交叉持股法律规制研究[D].浙江工商大学,经济法学,2012,硕士.
[17]马骏.探析我国电子商务与物流协同发展[J].信息与电脑,2014,07:72-76.
[18]王德涛.基于共同配送模式的整车物流配送路径优化研究[D].长安大学,载运工具运用工程,2013,硕士.
[19]崔润琼.兰州市城投公司投融资模式创新研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[20]郑涛,刘敏,董淑惠.基于故障相并联补偿电流变化特征的单相自适应重合闸[J].电力系统自动化,2011,10:74-78.
[21]张晓萍.网络谣言及其法律规制研究[D].重庆大学,新闻与传播（专业学位）,2014,硕士.
[22]李怡.中国冬季气温与影响因子关系的年代际变化特征和预测方法[D].中国气象科学研究院,气象学,2013,硕士.
[23]任立立.基于全桥变换器的电磁式双凸极电机调速系统的建模与控制[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[24]王荣华.双源CT双能量扫描在淋巴瘤与转移性淋巴结鉴别诊断中的分析研究[D].山西医科大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[25]沈陈镱.量子算法的设计研究及应用[D].华东交通大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[26]姚冬芹.羽毛粉固态发酵过程中产氨及除氨的研究[D].南京农业大学,临床兽医学,2012,硕士.
[27]安村青,林向阳,洪必恭.宝华山主要植被类型土壤种子库初探[J].植物生态学报,1996,01:41-50.
[28]李浩君,项静,吴亮亮.概念图理论在移动学习资源设计中的应用研究[J].中国远程教育,2013,07:76-82.
[29]倪志伟,李学俊,胡彩平,李锋刚.基于范例和规则相结合的推理技术[J].小型微型计算机系统,2004,07:1155-1158.
[30]石鹏.Smarandache函数的下界估计及相关函数的混合均值[D].西北大学,基础数学,2013,硕士.
[31]毛福群.三峡库区重庆段城镇供水可持续发展研究[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[32]孔祥鹏.空气源热泵中温相变蓄能除霜特性的实验研究[D].哈尔滨理工大学,热能工程,2013,硕士.
[33]高德明.城市污水排污调节阀调节性能研究[D].兰州理工大学,化工过程机械,2013,硕士.
[34]张春风.多智能体系统的群一致性研究[D].天津大学,运筹学与控制论,2013,硕士.
[35]韩蓉.猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用及Nsp2蛋白单克隆抗体的制备[D].南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士.
[36]彭韵清.论当代初中生的传统美德教育[D].江西师范大学,教育管理,2003,硕士.
[37]蒋殿惠.高尔基文学创作中的民间文学元素[D].黑龙江大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[38]周荣新.论WTO中的补贴概念[D].中国政法大学,国际法学,2004,硕士.
[39]程哲,杨军,叶廷路,张涌,王强,彭晓涛.考虑机组分区排序的河北南网节能调度安全稳定分析[J].电力系统自动化,2010,12:95-99.
[40]王艳玮.我国普通高校本科人才培养质量保障的问题与对策研究[D].华中师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[41]杨漫欣.初中学习不良学生的元认知调节特征及训练[D].首都师范大学,发展与教育心理学,2004,硕士.
[42]李亚男.现代汉语“述·结·宾”结构研究[D].扬州大学,语言学及应用语言学,2011,硕士.
[43]龙学正.古今中外天然抗肠道真菌药物的文献筛选研究[D].湖南中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[44]秦鑫.清代医者形象研究[D].大连大学,中国古代文学,2014,硕士.
[45]包莹.石墨烯基磁性纳米复合物的制备及其性能研究[D].西北师范大学,无机化学,2013,硕士.
[46]刘昱彤.多元价值取向背景下大学生纪律教育研究[D].长安大学,思想政治教育,2014,硕士.
[47]郭春明.第三人执行异议之诉研究[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[48]郭英新.ω-结构与一类特殊的LF-网空间[D].曲阜师范大学,基础数学,2004,硕士.
[49]王山东,陈竹林.大型企业设备运行系统研究与开发[J].化工自动化及仪表,2004,03:38-41.
[50]刘婷.基于业务流程管理的房地产开发企业营运资金管理研究[D].重庆大学,技术经济及管理,2014,硕士.