谷氨酸棒杆菌中分枝硫醇的生理功能研究

【摘要】谷氨酸棒杆菌被广泛用于氨基酸的工业发酵，以及核苷酸和维生素的生产。近年来的代谢工程研究表明，谷氨酸棒杆菌可以用于诸如生物基有机酸、乙醇、二胺、多聚物以及其它高价值的蛋白等化学品、材料和燃料的生产，作为生物基细胞工厂生产人类所需物品。然而，在生物基产品发酵过程中，常常伴随着各种各样的胁迫环境，显然，提高谷氨酸棒杆菌对上述胁迫下的耐受性及工业性能鲁棒性对生物基产品的生产有重要意义。各种胁迫通常有一个共同的效应—氧化胁迫，通过产生活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），进而对生物大分子造成损伤。生物体为应对氧化损伤进化出两套策略：酶系统和非酶的抗氧化剂系统，后者主要是一些小分子的硫醇，包括半胱氨酸Cys、辅酶A（CoA）、维生素C、E和谷胱甘肽（glutathione，GSH）。其中，GSH的研究最为透彻。GSH代谢途径已被用于细菌的生理功能工程改造，成功改善了细菌在胁迫下的鲁棒性。然而，包括谷氨酸棒杆菌在内的放线菌目并不具备GSH代谢途径，取而代之的是另一种小分子硫醇（mycothiol，MSH）。研究表明，MSH参与氧化剂、毒素、抗生素及芳烃化合物的解毒过程。近年来，有关MSH的研究主要围绕结核分枝杆菌等致病菌展开，MSH代谢是此菌生长必需，因此，学术界将研究热情主要投入到MSH作为新的药靶研究中，而关于MSH的生理功能的挖掘则暂时搁置，谷氨酸棒杆菌中MSH的生理功能更是无人问津。因而，MSH的抗氧化性能能否成为塑造谷氨酸棒杆菌的生物鲁棒性的重要手段，是本研究的主要研究目的。在本研究中，我们以谷氨酸棒杆菌为研究对象，揭示了MSH的生理功能及其发挥作用的内在机制，主要结果如下：1我们采用野生菌、MSH缺陷突变体及其互补菌，检测了MSH在谷氨酸棒杆菌中对烷化剂、氧化剂、抗生素、重金属、农药、酸、乙醇和芳烃的解毒作用。结果表明，MSH突变体对毒素（丙酮醛、CDNB、mBBr、碘乙酰胺）、氧化剂（H2O2、Diamide）、抗生素（红霉素、链霉素、新霉素、壮观霉素、庆大霉素）、萘、间苯二酚、草甘膦、乙醇和重金属（CdCl2、ZnCl2、CoCl2、MnCl2、CuSO4）胁迫高度敏感，即表明MSH介导了谷氨酸棒杆菌对上述胁迫的解毒过程，揭示了MSH在谷氨酸棒杆菌中的生理功能。2我们以酸胁迫为例，揭示了MSH发挥抗性的内在机制。我们发现，MSH突变体因丧失MSH导致酸胁迫下存活率急剧下降。MSH突变体对酸敏感的内在因素是因为缺失MSH，导致了胁迫下胞内活性氧水平显著增加，胞内pH显著降低，胞内蛋氨酸库缺陷严重。即MSH发挥酸抗性的内在机制是：(1)胁迫下维持相对较高的胞内pH；（2）清除酸胁迫产生的ROS；（3）翻译后修饰MetE，保护蛋氨酸合成途径免遭酸胁迫损伤。3既然MSH具有多种多样的抗胁迫功能，且上述胁迫是谷氨酸棒杆菌作为生物基产品的生产平台常常遭遇到的，因此，通过MSH过量合成有望提高其对胁迫的抗性，改善其工业性能。于是，我们通过基因工程在谷氨酸棒杆菌中过表达MshA，发现MshA过表达后，MSH的含量大幅度提高；在H2O2(40mM)、丙酮醛(5.8mM)、红霉素(0.08mg/mL)、链霉素(0.005mg/mL)、Cd2+(0.01mM)、Mn2+(2mM)、甲酸(0.05%)、乙酸(0.15%)、乙酰丙酸(0.25%)、糠醛(7.2mM)和乙醇(10%)等胁迫下，较之于野生菌，MshA过表达菌株的存活率分别增加了43.8,39.4,90,77,131,87.3,51.9,46.9,57.4,85.2,32.5%;胞内的ROS水平也显著降低。在H2O2（33mM）、乙酸（0.05%）、糠醛（16.7mM）、乙醇（6.5%）、CdCl2（15μM）胁迫下，过表达菌产生的Glu、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Try、Phe、His等氨基酸含量的增幅在10.2~100.3%。即MSH可以显著改善谷氨酸棒杆菌在胁迫下的鲁棒性，可以作为谷氨酸棒杆菌生理功能工程的改良策略。
【作者】刘应保；
【导师】沈锡辉；
【作者基本信息】西北农林科技大学，微生物学，2014，博士
【关键词】谷氨酸棒杆菌；分枝硫醇；生理功能；发酵逆境；鲁棒性；

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