普通小麦—华山新麦草异附加系分子细胞遗传学研究及其SCAR标记开发

【摘要】华山新麦草（PsathyrostachyshuashanicaKeng;2n=2x=14,NsNs）具有早熟，抗病（条锈、叶锈、全蚀、赤霉、白粉），抗逆（抗寒、抗旱、抗盐、耐瘠薄），高产，优质，矮秆等优良特性，是进行小麦改良的重要遗传资源。而小麦-华山新麦草异附加系和代换系是进行小麦改良的重要中间材料，对其进行分子细胞遗传学研究和优异基因评价，有利于更有目的、更有效的利用Ns基因组中的优异基因。本研究以小麦-华山新麦草衍生后代为主要研究对象，采用细胞学观察，原位杂交（GISH和FISH），生化标记（SDS-PAGE和A-PAGE），分子标记（SSR、EST-SSR和EST-STS）及形态学分析与农艺性状评价等方法，进行异附加系和代换系的Ns染色体与小麦染色体间的部分同源群关系、附加系和代换系的抗病性与农艺性状研究，以期建立1Ns–7Ns的全套小麦-华山新麦草二体异附加系和部分代换系，明确各附加系和代换系的主要农艺性状，筛选携带华山新麦草优异基因的小麦新种质，为高效、快速、明确地利用华山新麦草优异基因进行小麦遗传改良奠定材料基础。另外，本研究利用华山新麦草特异SCAR标记对小麦-华山新麦草全套二体异附加系进行PCR分析，区分小麦背景中不同的华山新麦草染色体，开发华山新麦草染色体特异SCAR标记，建立华山新麦草遗传物质分子标记辅助筛选体系。主要研究结果如下：1．小麦-华山新麦草全套(1Ns–7Ns)二体异附加系的筛选鉴定：利用细胞学和基因组原位杂交（GISH）技术对小麦-华山新麦草衍生后代体细胞有丝分裂和花粉母细胞减数分裂中期染色体进行鉴定，检测衍生后代的染色体数目和结构，筛选包含42条小麦染色体和1对华山新麦草染色体的小麦-华山新麦草二体异附加系(2n=44=22Ⅱ)。利用种子贮藏蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE和A-PAGE）和小麦7个部分同源群长、短臂上的多位点EST-SSR和EST-STS引物835对，对小麦-华山新麦草二体异附加系进行电泳检测和PCR分析，确定附加系的Ns染色体与小麦染色体间的部分同源群关系，建立1Ns–7Ns的全套小麦-华山新麦草二体异附加系。分别利用我国目前流行的小麦条锈病生理小种（CYR31、CYR32和Su11-14）和叶锈病小种（FHTT、PHST和FHST）的混合小种对全套二体异附加系成株期进行抗病性鉴定。通过田间观察和室内考种对1Ns–7Ns全套二体异附加系农艺性状进行全面系统的评价。结果表明1Ns二体异附加系12-3被导入了华山新麦草特异麦谷蛋白和醇溶蛋白基因，并且高抗小麦叶锈病。2Ns二体异附加系3-6-4-1高抗条锈病，千粒重50g以上。3Ns二体异附加系22-2高抗条锈病，株高最矮。4Ns二体异附加系24-6-3多分蘖，品质优良，高抗条锈病。5Ns二体异附加系3-8-10-2株型紧凑，产量性状明显优于小麦亲本7182，且高抗条锈病。6Ns二体异附加系59-11早熟，具附小穗性状，平均单穗结实90粒以上，被导入了华山新麦草α-醇溶蛋白基因。7Ns二体异附加系2-1-6-3抗叶锈病，结实率高。上述研究表明，通过综合利用细胞学、GISH、SDS-PAGE、A-PAGE、EST-SSR和EST-STS等方法，成功分离鉴定出了小麦-华山新麦草(1Ns–7Ns)二体异附加系(2n=44=22Ⅱ)。农艺性状评价表明，全套二体异附加系被引入了不同的华山新麦草优异基因，整体性状优于小麦亲本7182。因此，全套二体异附加系的成功分离和鉴定为高效、快速、明确的利用华山新麦草优异基因进行小麦遗传改良奠定了材料基础。2．大穗、多花、多籽粒小麦-华山新麦草异代换系16-6的筛选鉴定：利用细胞学、基因组原位杂交（GISH）、SSR、荧光原位杂交（FISH）和EST-STS对小麦-华山新麦草衍生系16-6进行了分子细胞遗传学研究。细胞学和GISH表明16-6体细胞有丝分裂和花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体数目和结构为(2n=42=21Ⅱ)，1对华山新麦草染色体被导入16-6，初步确定16-6为小麦-华山新麦草二体异代换系。利用位于小麦7个部分同源群长、短臂上的单位点SSR引物对16-6进行PCR分析，确定了16-6中的2D染色体被代换。再利用位于小麦2DS和2DL染色体上的16对SSR标记和以pAs1为探针的FISH对16-6进行鉴定，进一步确定了16-6中的2D染色体被代换。为了确定导入16-6中的华山新麦草染色体和小麦染色体的部分同源群关系，利用小麦7个部分同源群长、短臂上的780对多位点EST-STS引物对小麦-华山新麦草异代换系16-6进行PCR分析，确定了导入16-6中的1对华山新麦草染色体为2Ns，最终确定了16-6为2Ns(2D)二体异代换系。利用我国目前流行的小麦条锈病生理小种（CYR31、CYR32和Su11-14），混合对异代换系进行成株期抗病性鉴定，结果显示16-6高抗条锈病。农艺性状评价显示16-6具大穗、多花、多籽粒特性，其穗长、小穗数和穗粒数显著高于小麦亲本7182。因此，2Ns(2D)二体异代换系16-6是进行小麦高产和抗病育种的理想供体材料。3．华山新麦草特异SCAR标记开发：利用华山新麦草特异SCAR标记对小麦-华山新麦草全套二体异附加系进行PCR分析，区分小麦背景中不同的华山新麦草染色体，开发华山新麦草染色体特异SCAR标记。结果显示2对SCAR引物（RHS23和RHS141）在华山新麦草和全套二体附加系中均扩增出了特异条带，2对SCAR引物（RHS153和SHS10）在华山新麦草和1Ns二体附加系中扩增出了特异条带，3对SCAR引物(RHS7、RHS14和RHS103)在华山新麦草和5Ns二体附加系中扩增出了特异条带，而小麦亲本7182中均未扩增出相应条带。说明RHS23和RHS141为华山新麦草基因组染色体特异SCAR标记，RHS153和SHS10为华山新麦草1Ns染色体特异SCAR标记，RHS7、RHS14和RHS103为华山新麦草5Ns染色体特异SCAR标记。这些华山新麦草染色体特异SCAR标记将被作为重要的工具用于小麦背景中华山新麦草染色体的分子标记筛选鉴定。普通小麦-华山新麦草1Ns–7Ns全套异附加系和2Ns(2D)异代换系的分子细胞遗传学研究与优异基因新种质的筛选，对于阐明华山新麦草Ns基因组与小麦基因组间的遗传关系，更有针对性的利用Ns基因组中的优异基因进行小麦遗传改良具有重要的理论和实践意义。华山新麦草染色体特异SCAR标记的获得，为早期准确、快速、高效地鉴别小麦-华山新麦草衍生后代外源染色体提供了有利工具，提高了小麦背景中华山新麦草染色体的鉴定效率。对进一步有计划地转移华山新麦草有益基因，创制可直接用于生产的优良易位系或育种中间材料具有重要的理论和实践意义。
【作者】杜万里；
【导师】陈新宏；武军；
【作者基本信息】西北农林科技大学，种子工程，2014，博士
【关键词】小麦；华山新麦草；异附加系；分子细胞遗传学；特异标记；

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