矮秆基因Rht12对小麦重要农艺性状的遗传效应及新矮秆突变体的筛选

【摘要】株高是影响小麦产量的主要因子之一，矮秆基因的发现和利用大幅提升了世界小麦产量，并引发了第一次“绿色革命”，为解决世界粮食问题做出了巨大贡献。然而，目前生产上应用的小麦矮秆基因比较单一，主要为赤霉素不敏感型矮秆基因Rht1和Rht2，且其潜力已发挥殆尽，不利于产量和品质的持续提升；同时，研究也发现Rht1、Rht2会缩短胚芽鞘长度，影响苗期活力，尤其在干旱情况下会影响出苗和幼苗群体的建成；而赤霉素敏感型矮秆基因（Rht4、Rht5、Rht12、Rht13等）在降低株高的同时，对胚芽鞘长度等性状没有负面影响，重新认识这些矮秆基因，促进其合理利用，对进一步提高小麦生产潜力具有重要的理论和实践意义。赤霉素敏感型矮秆基因Rht12可显著降低株高（约45％），目前对其遗传效应、致矮机理等还不清楚，应用价值尚不明确。因此，本研究对Rht12进行较为全面的分析，为其合理利用奠定基础。研究以小麦赤霉素敏感型矮秆基因Rht12的供体亲本Karcagi分别与中国春性小麦品种宁春45（含Vrn-B1）和冬性品种晋麦47（含Ppd-D）进行杂交，通过分子标记辅助选择，以目的基因纯合的株系构建F2:3及F3:4遗传群体，调查各基因型的发育进程、株高、穗粒数、千粒重等相关农艺性状，以明确Rht12对各性状的效应及Rht12与Vrn-B1和Ppd-D的互作。同时，利用外源赤霉素（GA3）对Karcagi×宁春45的群体进行处理，分析了Rht12对外源GA3的反应，以揭示Rht12和赤霉素合成或信号转导间的可能关系，分析其致矮机理。另外，为了发掘更多的矮秆材料或矮秆基因，研究还构建了一个小麦EMS诱变群体（TILLING群体），并对其突变表型和突变频率进行了分析，初步鉴选了一批综合性状较好的矮秆突变体，为矮秆基因的深入研究和新矮秆材料的创制奠定了基础。本研究的主要结果如下：1.矮秆基因Rht12的遗传效应及其与Vrn-B1的互作通过两年、三个播期的试验，对Karcagi×宁春45的F2:3及F3:4各基因型纯合株系农艺性状的分析结果表明，Rht12可显著降低株高，矮秆系的株高比高秆系平均降低了47.6cm(38.3％)，且这种致矮效应在苗期就表现出来；Rht12对茎节个数没有影响，其通过缩短每一茎节的长度来降低最终株高；其中，穗下茎的缩短幅度最大，较高秆系平均缩短了22cm(45％)；Rht12在缩短茎节长度的同时，不影响茎节直径，但增加了茎节壁厚，有利于提高其抗倒伏能力。在产量组成性状方面，Rht12可显著增加有效分蘖数（2个）；增加可育小花个数（10％），提高小花育性（13％），并最终增加了穗粒数，矮秆系的穗粒数比高秆系平均多4.1个（9.7％）；然而，Rht12显著减小了种子体积，降低了千粒重（20％）；最终，矮秆系的单株产量与高秆系无显著差异，但由于生物量较小，矮秆系的收获系数显著高于高秆系。同时，研究还发现Rht12可显著推迟小麦的幼穗发育进程，尤其是推迟了二棱期的出现，延长了营养生长的时间，其中，矮秆系（RRVV、RRvv）比高秆系（rrvv）晚到达二棱期约16天，且显性Vrn-B1不能打破Rht12的这一效应，最终，矮秆系比高秆系晚开花5～6天，导致其灌浆期较短，不利于充分灌浆。室内试验分析结果表明，Rht12对小麦胚芽鞘长度没有不利影响；苗期根系分析结果发现，Rht12尽管减少了初生根个数（2条）和初生根总长（6cm，9％），但显著增加了最大初生根长度（3cm，15％），有利于矮秆系在苗期吸取深层土壤中的水分。对Rht12与春化基因Vrn-B1的互作分析表明，春化基因Vrn-B1在高秆系中，可促进植株提前进入二棱期，表现出春性特性；而在矮秆系中，Vrn-B1促进幼穗发育的特性被完全掩盖，表明Rht12对春化基因Vrn-B1有上位性效应。2.矮秆基因Rht12与光周期基因Ppd-D1的互作效应为了改良Rht12的晚熟特性，试验引入了显性光周期基因Ppd-D1。对Karcagi×晋麦47的F2:3各纯合基因型株系的分析结果表明，Ppd-D1对营养生长时间（播种至二棱期）没有影响，矮秆系（无论含显性Ppd-D1还是隐性ppd-D1）仍需要较长的时间才能进入生殖生长阶段，其到达二棱期所经历的时间比高秆系多8天；然而，含显性Ppd-D1的矮秆系在生殖生长后期发育加快，仅需56.0天便到达开花期，而含隐性ppd-D1的矮秆系需60.5天才能到达开花期；含显性Ppd-D1的矮秆系要比含隐性ppd-D1的矮秆系早开花5天，仅比高秆系晚开花1～2天，基本上克服了Rht12延迟开花期的不利效应。在高秆系中，Ppd-D1也同样表现出促进早开花的特性，但其对植株到达二棱期所需的时长也没有影响。结果表明，尽管Ppd-D1不能打破Rht12延迟二棱期出现的不利效应，但其显著缩短了二棱期至开花期所用的时间，并促进植株早开花，因此，利用Ppd-D1来改良Rht12矮秆系的开花期是可行的。另外，在Karcagi×晋麦47群体中，Rht12同样显著的降低了株高（约40cm；38％），其中，含显性Ppd-D1的矮秆系（RRPP）最矮，可能是因为Ppd-D1与矮秆基因Rht8紧密连锁的原因；Rht12增加了有效分蘖个数，并显著提高了主茎穗粒数，矮秆系的主茎穗粒数比高秆系平均多2.5粒（5.8％），其中，RRPP、rrPP的穗粒数分别小于RRpp和rrpp,可能是由于显性Ppd-D1缩短了生殖生长后期所经历的时间，使小花发育的时间有所减少，影响了可育小花的分化；Rht12降低了千粒重，矮秆系的千粒重比高秆系平均小6.7g（14.9％），其中，显性Ppd-D1不同程度的增加了千粒重，可能是因为其促进植株早开花，有利于充分灌浆；最终，矮秆系的单株产量较高秆系稍低，但其收获系数显著大于高秆系；这些结果与Karcagi×宁春45群体的一致。因此，在利用Rht12提高小麦抗倒伏性、增加穗粒数和有效分蘖育种时，还可利用显性光周期基因Ppd-D1改良其千粒重较小的不利效应。3.矮秆基因Rht12对外源赤霉素（GA3）的响应通过两年、三个播期的赤霉素喷施试验，分析了Rht12对外源GA3的响应，结果表明，外源GA3可在一定程度上抵消Rht12的效应，使矮秆系恢复高秆表型。GA3打破了Rht12对Vrn-B1的掩盖作用，促进矮秆系较早进入二棱期，使含显性Vrn-B1的矮秆材料（RRVV）表现出春性特性；GA3处理的矮秆系较未处理的早开花约7天，且仅比未处理的高秆系晚开花1天；而GA3处理的高秆系只比未处理的早开花1.5天，反应程度显著小于矮秆系。另外，GA3处理后，矮秆系表现出类似于高秆系的生长能力，苗期株高和干物质量的增长速度都显著高于未处理的矮秆系；同时，GA3处理恢复了矮秆系失去的获得较长茎节的能力，增加了各茎节长度，其中，穗下茎的长度比未处理的平均增长19.3cm（81.5％）；GA3处理在增加茎节长度的同时，降低了茎节直径和壁厚，尤其是基部第一、第二茎节的直径和壁厚，显著降低了抗倒伏能力；GA3处理的矮秆系的株高比未处理的平均增加了40.7cm（53％），仅比高秆系矮5～10cm；而高秆系受GA3的影响要远小于矮秆系，株高仅增加了6.1cm（4.8％）。在产量组成性状方面，GA3处理弥补了Rht12降低千粒重的不利效应，增大了种子体积；不过，GA3处理减少了矮秆系的穗粒数和有效分蘖个数，并降低了单株产量和收获系数；而高秆系的产量组成性状并未受GA3显著影响。同时，油菜素内酯敏感性测定表明，Rht12不是BR缺陷型突变。因此，随着外源GA3对Rht12矮秆系各“矮化性状”的恢复，使其表现出类似于高秆系的表型，表明矮秆系的矮化特性很可能是其缺乏充足的内源赤霉素的结果，Rht12很可能是赤霉素合成缺陷型突变。4.小麦新矮秆突变体的筛选为发掘更多的矮秆突变体，构建了一个小麦品种晋麦47的EMS诱变群体（TILLING群体），对其表型变异和部分候选基因的突变体进行了调查与筛选。对M2突变群体的表型变异进行调查分析，发现了矮化、黄化、晚熟等丰富的变异类型，估算M2总的表型变异频率为4.2％；其中，矮秆半矮秆突变最多，占所有变异的32％。通过随机引物PCR扩增分析，估算M2在DNA水平上的突变频率约为1/35kb，即每35kb基因组序列中，就可能存在一个点突变；这些结果表明，该诱变群体不仅存在丰富的表型变异，其基因组水平上的变异更加丰富，为突变材料的选育及候选基因突变体的挖掘提供了有效的资源。进一步利用TILLING（TargetingInducedLocalLessionsInGenomes，定向诱导基因组局部突变）技术对光周期基因Ppd-D1及矮秆基因Rht-D1等基因的突变位点进行了检测，发现了Ppd-D1的15个点突变，Rht-D1的3个点突变，这些突变主要为C到T、G到A的转换突变，个别突变引起了氨基酸的改变，可能会对蛋白功能产生破坏性影响；对Ppd-D1和Rht-D1的突变体进行分析，发现这些突变可能并不是引起表型变化的直接原因。同时，为了鉴选农艺性状较好的矮秆突变体，用野生型材料（晋麦47）与部分矮秆突变体进行回交，并从回交后代中选择择株高适宜且能稳定遗传、开花较早、农艺性状较好的矮秆材料，为进一步深入研究奠定了良好的基础；同时，部分矮化相关基因（如赤霉素合成或信号转导相关基因）的突变体TILLING筛选也正在进行。总之，以上研究结果表明，赤霉素敏感型矮秆基因Rht12可显著降低株高、增加有效分蘖、穗粒数和收获系数，且对苗期活力没有负面影响；但有较强的延迟幼穗发育的的不利效应，育种应用时可通过配合使用Ppd-D1等促进生长发育的基因，以克服其延迟开花的不利效应。Rht12对外源GA3反应敏感，且GA3可以恢复矮秆系的高秆表型，推测Rht12很可能作用于内源赤霉素合成相关途径，而非信号转导途径。另外，在构建的TILLING突变群体中发现了丰富的矮秆材料；相关基因的突变也在进一步筛选中，这些研究将促进小麦新矮秆基因的发现与利用。
【作者】陈亮；
【导师】胡银岗；
【作者基本信息】西北农林科技大学，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】小麦；矮秆基因；Rht12；Vrn-B1；Ppd-D1；遗传效应；农艺性状；赤霉素响应；TILLING；矮秆突变；

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