氧—甲基转移酶Ubig和蓖麻毒素A链与抗体6C2复合物的结构生物学研究

【摘要】第一部分：Ubig/Coq3家族蛋白膜结合特性的结构生物学研究泛醌,又称为辅酶Q。它是一种具备氧化还原性的磷脂,普遍存在于原核生物的细胞质膜和真核生物的线粒体内膜。无论是在原核生物还是在真核生物中,泛醌最主要的作用都是在呼吸链中作为电子的载体。另外,泛醌与人类的各种疾病都是息息相关的,例如癌症,神经退行性疾病和帕金森综合症等。Ubig/Coq3家族是一类SAM依赖的O-甲基转移酶,负责催化泛醌合成过程中的二步甲基转移反应。在泛醌合成过程中,首先,UbiA/Coq2催化异戊二烯基焦磷酸脂与芳香族羟基苯基酸进行缩合反应,然后苯醌环再进行各种修饰,包括C-甲基化,脱羧化,O-甲基化和羟基化。正如我们了解的,UbiA/Coq2是一类含有多跨膜区的膜蛋白,负责在磷脂上催化异戊烯的转移反应。那么,Ubig/Coq3家族蛋白是如何锚定到生物膜上并催化甲基转移反应却是并不清楚的。在本论文中,我们首次揭示Ubig/Coq3家族蛋白具备膜结合能力,能够直接性的结合原核生物的细胞质膜和真核生物的线粒体膜。与一型的S-腺甘基甲硫氨酸依赖的甲基转移酶相比,Ubig拥有一段独特的插入序列。这段富含碱性和疏水氨基酸的区域,可以特异性的识别二种酸性的磷脂,磷脂酰甘油和心磷脂。有趣的是位于膜结合区的氨基酸残基从细菌到真核生物都是保守的,磷脂结合实验表明当突变人源Coq3相应的氨基酸残基为丙氨酸残基后,同样会影响人源Coq3对于线粒体膜的结合。我们推断这种膜结合的能力会帮助Ubig/Coq3家族蛋白捕获定位在细胞膜磷脂双分子层上的底物,并且对Ubig/Coq3家族蛋白在体内发挥甲基转移反应是必须的。另外,我们模拟了Ubig的S-腺甘基甲硫氨酸的结合位点,并发现其附近有一段非常保守的区域很有可能是负责催化反应。细胞表型回补实验表明这段区域的确对Ubig在体内发挥功能是必须的,肯定了我们上面的推测。总之,我们首次发现Ubig/Coq3家族蛋白可以直接结合到细胞膜上,并且解释了其膜结合的分子机制。我们的结果表明Ubig/Coq3家族催化的甲基转移反应是膜依赖的。第二部分：单克隆抗体6C2中和蓖麻毒素Ricin的结构生物学研究RIPs又称为核糖体失活蛋白,具备N-端的糖苷酶活性,可以分为2类。一型的核糖体失活蛋白是个单体,是一种分子量大约32000道尔顿的碱性蛋白,具备N-端的糖苷酶活性。二型核糖体失活蛋白是一个异二聚体,分子量大约66000道尔顿。其中一条链分子量大约32000道尔顿具备N-端的糖苷酶活性,第二条链分子量大约34000道尔顿拥有凝集素的特性,这两条链由二硫键连接。Ricin拥有二型RIPs的特性,能够不可逆的切除核糖体28SrRNA位于sarcin-ricinloop区内的腺嘌呤。抗体6C2是一种人鼠嵌合型的单克隆抗体,对蓖麻毒素Ricin有很好的中和效果,但是中和机制却是不知道的。在这篇内容中,我们测定了分辨率为2.8埃的蓖麻毒素A链与6C2抗原结合区段的复合物的晶体结构。这也是首个关于蓖麻毒素和单克隆抗体的复合物结构。结构表明抗体6C2主要依赖抗原决定簇的loop区来识别位于蓖麻毒素A链上第96位天冬氨酸残基到第116位苏氨酸残基这一段的表位肽。酶联免疫吸附实验证明位于表位肽中的第98位的谷氨酰胺残基,第99位的谷氨酸残基,第102位的谷氨酸残基和第105位的苏氨酸残基对于单克隆抗体6C2的识别是重要的。通过体外检测蛋白质的翻译水平,我们发现当突变这些氨基酸来破坏蓖麻毒素A链和单克隆抗体6C2的相互作用界面,抗体6C2对蓖麻毒素毒性的中和能力就会大幅度的丧失。最后,我们发现抗体6C2很有可能是通过阻碍蓖麻毒素A链和核糖体的相互作用从而实现中和毒素的目的。总之,我们的结果揭示了抗体6C2中和蓖麻毒素A链毒性的分子机制并为今后设计更高亲和力的抗体提供结构依据。
【作者】朱玉威；
【导师】滕脉坤；牛立文；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】膜锚定蛋白；泛醌合成；氧-甲基转移酶；核糖体失活蛋白；N-端糖苷酶；蓖麻毒素A链；蓖麻毒素B链；抗体；抗原；抗体复合物；抗原结合区；

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