基于高通量DNA芯片合成、测序技术的抗体亲和力成熟研究

【摘要】ErbB2是ErbB受体家族的成员之一,它在一些上皮细胞肿瘤中,尤其是乳腺癌和卵巢癌中过表达。它的过表达往往预示着肿瘤的迁移和侵润性强,恶性化程度高以及愈后差,因此ErbB2是肿瘤治疗研究中一个重要的靶分子,对它的研究也非常多,尤其是针对它的特异性抗体的研究。本实验室在前期工作中通过表面表位包埋法获得了一株抗ErbB2的鼠单克隆抗体mA21,并对它进行了一系列的工程化改造,包括将A21的轻链可变区和重链可变区通过GSlinker相连构建出A21单链抗体(A21scFv),以及将单链抗体接到人的IgGFc段上构建人鼠嵌合抗体chA21。体内外实验表明chA21能够特异的抑制ErbB2过表达的肿瘤细胞生长。然而天然免疫系统得到的抗体亲和力相对比较较低(chA21亲和力为10nM),为了进一步开发该抗体的临床应用,需要对它进行亲和力成熟。传统的亲和力成熟方式是通过PCR随机突变抗体的抗原互补决定区(CDRs),然后将突变体展示在噬菌体表面,进行高亲和力突变株的筛选。我们尝试了这种建库方式,但因为它需要经历搭桥PCR以及酶切和连接的步骤,操作麻烦。另外由于噬菌体库容的限制,一个CDR区往往要构建多个库进行分别筛选,非常费时费力。更重要的是：由于是随机突变,构建好的库中存在着大量的冗余序列,并且抗体的识别表位可能发生变化,这就降低了筛选到目的抗体的机率,增加了工作量。在此我们在第二代高通量合成和测序技术基础上,发展了一个新的建库策略,能够有效解决以上问题。首先,我们采用生物信息学的方法对A21抗体的6个CDR区按Kabat数据库进行分类,再参照相同类别下已知抗体的序列设计突变,这样就保证了突变设计的合理性,避免随机突变导致的抗体结合抗原表位的变化,维持了抗体的稳定性,并大大减少了冗余序列。将设计好的突变体用微流体芯片合成技术进行准确合成并用solexa高通量测序分析,保证了芯片合成的准确率,使库容量的需求从常规方法的1010以上降低到只需105次方。这是第一次将生物信息学与微流体芯片合成和测序技术结合应用于抗体的亲和力成熟。进一步,以合成的突变序列作为引物,带有野生型抗体的噬菌体重组载体作为模板,将Stratagene公司的一般突变试剂盒用于构建突变库,每一个CDR区的突变库只需要进行一次PCR和转化,就可以拿到符合要求的突变质粒库,中间不需要经过任何酶切和连接步骤,非常方便快捷,克隆计数和随机测序结果显示,获得的突变库库容达到理论库容的3到10倍以上,并随机出现设计的突变序列,完全达到建库要求。这也是第一次将定点突变试剂盒的原理应用于库的构建。在上述采用微流体芯片合成技术和一次性PCR建库的基础上,我们快速有效的构建了6个CDR区的突变质粒库和噬菌体展示库,并分别对6个CDR区的突变库进行了筛选,筛选到的克隆用SPR和ELISA法判定相对亲和力。对亲和力高于或者相当于野生型的克隆进行序列分析,获得每个CDR区对亲和力提高或者维持有意义的突变序列信息,并基于该信息构建了除VHCDR3以外5个CDR区的组合突变库。对组合库使用不同浓度梯度的抗原进行了多轮筛选,并将部分有潜力的克隆转入真核表达系统进行表达和相对亲和力比较,目前已经从组合库中获得了多个亲和力有所提高的克隆,其中最高的克隆亲和力提高了约20-30倍。另外我们还比较了不同筛选条件的影响,包括固相和液相筛选,不同的洗脱条件等。由于VHCDR3在Kabat数据库中没有找到相应的分类,按照上述方法构建的VHCDR3突变库中没有筛选到亲和力较好的克隆,而VHCDR3在抗原抗体结合中起非常重要的作用,因此我们又以5个CDR区组合库筛选到的克隆作为模板,再次构建了VHCDR3随机突变库。预期会有亲和力提高更多的克隆出现。综上所述,我们提出并采用了一个新的建库方式,它能够快速构建突变展示库,并且可以有效的筛选出亲和力提高的抗体,这是对抗体亲和力成熟和噬菌体展示技术的一个有益改进和补充。
【作者】徐曼；
【导师】刘兢；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2010，博士
【关键词】ErbB2；A21抗体；噬菌体展示；抗体亲和力成熟；高通量合成和测序技术一步PCR建库法；

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