永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪轮状病毒对其影响的研究

【摘要】在体外培养条件下，正常组织来源的细胞通常经过有限次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡。原代猪小肠上皮细胞（pSIECs）与其他正常组织来源的细胞一样，在体外经过8～13次的传代后，就停止分裂增殖。猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PRV)是引起仔猪腹泻的主要病原之一，在体外，轮状病毒虽可吸附于多种细胞，但只感染来源于肠道上皮的细胞和肾细胞。轮状病毒的吸附和感染过程需要胰蛋白酶的参与来增加病毒对宿主细胞的感染性，通常在无血清的条件下培养宿主细胞。然而，原代小肠上皮细胞对无血清培养极其敏感。另外，原代小肠上皮细胞的扩大培养也相当困难。尽管使用异源性细胞培养模型也可以获得很多有价值的信息，但是这些细胞可能不能应用于猪，因为不同的轮状病毒株具有种属差异性，细胞受体及因子的差别都会影响轮状病毒的吸附、感染、复制及致病性。这些难题阻碍了对猪轮状病毒（PRV）致病机理研究的进程。因此，研究轮状病毒的致病机理，同源性宿主细胞的获得极其必要。本研究的目的是通过转染外源基因的办法延长体外培养的猪小肠上皮细胞的寿命，建立具有正常上皮细胞形态和功能的永生化猪小肠上皮细胞系，然后研究猪轮状病毒对该细胞的影响及机制，获得了以下研究结果：1.永生化猪小肠上皮细胞系的建立（1）通过脂质体转染法将pCI-neo-hTERT真核表达质粒导入pSIECs中。对转染细胞进行hTERTmRNA水平、蛋白水平和端粒酶活性检测表明，hTERT基因可以在猪小肠上皮细胞中稳定表达并激活端粒酶活性，延长细胞寿命的同时，保留着原代细胞的形态学特征，揭示永生化细胞的端粒酶显著上调的原因在于pCI-neo-hTERT质粒的成功导入。（2）hTERT介导的永生化猪小肠黏膜上皮细胞被命名为SIEC02。SIEC02细胞在形态学结构和超微结构上都和原代猪小肠上皮细胞具有相同的上皮样特征；SIEC02细胞中CK18、Pan-cytokeratin和Occludin蛋白表达均为阳性，表明该细胞为上皮细胞来源；染色体核型分析表明SIEC02细胞有38条染色体，与正常生理状况下猪染色体的数目相同；SIEC02细胞体外培养具有血清依赖性，具有接触抑制的特性，能形成单层细胞，无裸鼠致瘤性和悬浮生长能力。检测结果表明，SIEC02细胞为非转化的猪小肠上皮细胞。2.永生化猪小肠上皮细胞的生物学功能（1）细菌黏附和入侵研究结果表明，猪源产肠毒素型大肠埃希菌和猪源弱毒型大肠埃希菌均能够有效黏附到SIEC02细胞上；沙门菌对原代猪小肠上皮细胞和SIEC02细胞的侵入效率（R）分别为30.5%和24.3%，说明SIEC02细胞和原代细胞均能有效内吞侵入性细菌，致病性细菌成功感染肠道上皮细胞。结果表明永生化猪小肠上皮细胞系SIEC02适合作为研究肠上皮细胞与肠道病原菌相互作用的体外模型。（2）沙门菌感染SIEC02细胞能够引起IL-8和TNF-αmRNA表达上调；相反，LPS刺激则能诱导IL-8和TNF-α基因在转录水平显著性下调，但会显著性上调TLR4和TLR6基因。沙门菌能够诱导SIEC02细胞分泌IL-8蛋白，而LPS无此功能。（3）血清（FBS）对猪小肠上皮细胞免疫学功能影响的研究结果表明，在正常血清含量培养条件下，SIEC02细胞能够表达编码CCL20、IL-8、IL-1α、IL-15、IL-18、MyD88、NF-κB、NOD2、pPGRP-L2、TLR4、TLR7、TNF-α的基因，而且没有丢失肠上皮细胞的特性，能够表达肠上皮细胞标记分子CD47、CLDN3、CLDN4、OCLN、ICAM1、KRT8、MUC1、VILLN和CD58。相对于对照组正常培养的SIEC02细胞来说，无血清培养组中细胞免疫相关基因TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR9、NOD2、OCLN、PGRP-L1、TGFβ1、IL-7、CCL2、GM-CSF、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8和IL-1β都呈现上调趋势，而TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10、NOD1、IL18、IL2、caspase1、IL-15、PGRP-L2、CCL20、FCGR3β、IL-10和IL-12p40则全部下调；上皮细胞标记基因MUC1、CLDN3、CD47、ICAM1和Keratin8在无血清的条件下全部呈现降低趋势，但IL-6、IL-15、Villin、IL-2和IL-1a均无明显变化。3.猪轮状病毒感染对猪小肠上皮细胞的影响（1）猪轮状病毒感染细胞试验表明，猪轮状病毒AV55株可使SIEC02细胞发生细胞病变（CPE），而OSU株则不能。这说明同种动物的不同血清型轮状病毒诱导的细胞的病变和凋亡是不同的。（2）猪轮状病毒感染SIEC02细胞16h后，直接免疫荧光可检测到病毒蛋白的表达；轮状病毒感染SIEC02细胞并不具有时间依赖性，但会发生MOI依赖性凋亡。4.猪轮状病毒NSP4的亚细胞定位及对猪小肠上皮细胞凋亡的影响激光共聚焦显微镜结果显示，猪轮状病毒NSP4及其viroporin定位于内质网；猪轮状病毒诱导猪SIEC02细胞凋亡的主要原因是病毒NSP4蛋白中的viroporin引起的Bax蛋白活化而造成，说明猪轮状病毒NSP4viroporin诱导的细胞凋亡部分依赖于细胞caspase的活化。综上所述，本研究成功建立了永生化猪小肠上皮细胞系（SIEC02），其具有正常的生物学特性和免疫学功能；明确了猪轮状病毒感染能够导致SIEC02细胞产生CPE，并发生MOI依赖性凋亡；确定了猪轮状病毒NSP4蛋白及其viroporin定位于内质网，NSP4viroporin诱导的细胞凋亡部分依赖于caspase的激活。
【作者】王静；
【导师】张彦明；
【作者基本信息】西北农林科技大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】猪小肠上皮细胞；永生化；猪轮状病毒；NSP4蛋白；viroporin；细胞凋亡；

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