SDF-1α/Rac途径在内皮祖细胞极性调控与归巢中的作用研究

【摘要】近十几年来,有关干细胞治疗退行性疾病和坏死性疾病,即细胞替代疗法研究是热点。在冠心病心肌梗死或心力衰竭的细胞治疗中,细胞类型的选择上,内皮干/祖细胞是一个有希望的新生血管来源。但其“归巢”和迁移机制复杂,目前归巢和细胞再生能力差,未能临床应用。本研究为基础研究,探讨新的人内皮祖细胞(humanendothelialprogenitorcells,hEPCs)归巢调控蛋白和可能的信号通路。本研究拟验证Rac蛋白在hEPCs归巢中的重要作用,为冠心病的细胞治疗提供新的作用途径。实验共分为以下三个部分：第一部分人内皮祖细胞的培养与鉴定及大鼠内皮祖细胞的培养[摘要]目的：建立本实验室离体hEPCs(以后所出现EPCs,若无特殊说明,都为本实验中分离出的hEPCs)培养的方法,探讨培养条件、细胞生长状态、形态。与大鼠EPCs(rEPCs)培养条件和生长情况对比。方法：取人脐带血80-120ml/袋,先分离单个核细胞,后使用磁珠细胞分选法(MACS),分选出CD133+/VEGFR2+的细胞,进行流式细胞检测,发现双阳性细胞占48.79%。用差速贴壁法培养5-9天,做常规拍照、免疫荧光染色拍照和细胞极性研究。结果：(1)hEPCs在普通光镜下呈索条状、卵圆形。(2)细胞吞噬DⅡ-acLDL、FITC-UEA染料后可在荧光显微镜下特异显色,证明细胞有吞噬功能,推断为EPCs。(3)CD133+/VEGFR2+细胞,占使用MACS筛选后细胞比例为48.79%。(4)从骨髓中分离出的rEPCs生长活力明显优于hEPCs.结论：(1)该方法培养hEPCs生长活性好,在普通光镜下呈索条状、卵圆形；浓度高,可以用于以后的细胞实验；但生长状态差于rEPCs;(2)差速贴壁法培养的hEPCs培养5天,可以吞噬DⅡ-acLDL、UEA染料,呈特异显色。第二部分SDF-1α对人内皮祖细胞极性和迁移的影响[摘要]目的：通过荧光显微镜观察分离出的hEPCs在SDF-1作用下极性和细胞骨架蛋白、受体分布的变化,通过细胞迁移板Zigmondchamber来观察hEPCs的迁移能力。方法：采用不同浓度的SDF-1α不同时间点与hEPCs作用,观察细胞形态,进行细胞拍照。使用Fitc和Rac总蛋白荧光染料主要观察了三个指标：CD133,GBP/Rac,F-actin(肌动蛋白纤维或肌动蛋白微丝)。结果：(1)光镜下观察,可见细胞形态变得细长,胞体拉伸,出现两极的“极化”现象。(2)细胞表面受体分布的变化,在SDF-1α作用组(25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml)1h、2h、6h、12h、24h时,CD133、GBP/Rac,F-actin的表达呈SDF-1α剂量依赖(至少与空白对照组相比),即与SDF-1α的浓度正相关;其中在SDF-1a200ng/ml的剂量组,CD133、GBP/Rac,F-actin在12小时时表达最高,而不是24小时。CD34的表达呈时间依赖,在24h时表达最高,而Racl的表达不随时间依赖,在12h时表达最高。细胞表面受体CXCR4、CD18、Integrina4表达的研究中,CXCR4呈时间依赖,在24小时时表达最高,而CD18和Integrina4的表达不呈时间依赖。(3)在Zigmondchamber趋化分析皿中观察单个hEPC的迁移(24小时内)。通过建立总体hEPCs的迁移的综合向量(纵向Y和横向X)分析,可以计算出hEPCs迁移的角度和程度,定量证明了SDF-1α作用下hEPCs定向迁移能力加强。结论：hEPCs在SDF-1α诱导下极性发生了变化,无论在细胞形态还是细胞受体的分布均发生改变,同时hEPCs的细胞群向SDF-1α方向发生了定向迁移。第三部分SDF-1α对Rac蛋白调控分子机制的初步研究[摘要]目的：使用PCR测定SDF-1α诱导hEPCs中Rac1,Rac2表达,与第二部分受体分布中SDF-1α浓度和随时间变化结合,探索体外诱导最强“归巢”能力hEPCs的SDF-1α剂量和时间点。观察SDF-1α诱导Rac表达是否与CXCR4和p38MAPK有关。方法：分为用SDF-1α在不同的干预时间点(1h,2h,6h,12h,24h)与hEPCs共培养后,提取细胞RacRNA测定其mRNA的表达变化,同时测定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表达变化。分别使用CXCR4的抑制剂AMD3100和p38MAPK的阻断剂SB203580干预SDF-1α和hEPCs的共培养,测定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表达变化。结果：PCR电泳图谱观察到racl和rac2都是在12小时表达量最高。而探究SDF-1α与hEPCs中Rac蛋白及Rac-GTP蛋白表达的关系,根据Western的0D值计算,在12小时Rac及其活化的Rac表达最高。加入CXCR4的抑制剂AMD3100后,racl和rac2蛋白表达的抑制率分别为：57.1%和62.2%。加入p38MAPK的抑制剂,即为SB203580后明显抑制了SDF-1α诱导的Rac-1和Rac-2蛋白表达。结论：(1)调控Rac表达的最佳SDF-1α浓度为200ng/ml,最佳时间点为12小时；(2)SDF-1α调控Rac的表达是CXCR4和p38MAPK依赖的。结论1.hEPCs在SDF-1α诱导下(分1h、2h、6h、12h、24h五个时间点)极性发生了变化,无论在细胞形态还是细胞受体的极化均发生改变,同时hEPCs的细胞群向SDF-1α方向发生了定向迁移。2.在200ng/mlSDF-1α作用下,Rac蛋白在的亚型racl和rac2其mRNA和蛋白都是在12小时表达量最高。加入CXCR4的抑制剂AMD3100,Rac1和Rac2蛋白表达明显减少；加入p38MAPK的抑制剂SB203580后Rac-1和Rac-2的表达亦明显减少,说明SDF-1α上调Rac表达,是CXCR4和p38MAPK信号通路依赖的。潜在价值和创新点1.建立了体外培养hEPCs的细胞培养体系;2.通过Zigmondchamber的观察证明,脐血来源的hEPCs向SDF-1α方向运动；3.体外调控Rac表达的最佳SDF-1α浓度为200ng/ml,最佳时间点为12小时;4.SDF-1α上调Rac表达,是CXCR4和P38MAPK信号通路依赖的。
【作者】高永兴；
【导师】钱菊英；
【作者基本信息】复旦大学，心血管内科学，2012，博士
【关键词】内皮祖细胞；培养；鉴定；DII-acLDL；FITC-UEA染料；内皮祖细胞极性；受体分布；迁移；Zigmondchamber细胞趋化皿；SDF-1α；Rac蛋白；CXCR4；p38MAPK；

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