应用拉曼光谱和超光谱成像技术识别周围神经纤维及神经束功能性质和显微结构的研究

【摘要】研究背景：周围神经损伤是骨科临床的常见疾病,其损伤后的修复与再生一直是国内外学者重点研究的课题。神经功能恢复不理想的主要原因是运动或感觉神经纤维之间的错向吻合。因此,如何在手术中对周围神经束的性质进行快速、准确的识别是当前迫切需要解决的问题之一,对于临床上周围神经损伤术中手术方式的选择具有较好的参考价值。过去临床上识别神经束功能性质的方法主要可归为以下几类：(1)根据解剖学特点和术中探查判断；(2)术中唤醒和电流刺激；(3)胆碱酯酶或碳酸酐酶组织化学染色；(4)同位素法测量乙酰基胆碱转移酶活性等。这些方法普遍耗时较长,不能满足手术中快速鉴别神经束功能性质的要求。近来有学者提出使用各种光学方法区分神经束功能性质的想法。拉曼光谱能够反映微小生物标本内核酸、蛋白质、脂质的含量及其化学结构和变化,具有实时快速、不破坏细胞、敏感性强、分辨率高、能够定性定量等优势；超光谱成像技术能同时提供生物组织样本图像和光谱两方面的信息,对检测标本进行定性、定量和定位的描述,相比其它医学成像技术具有独特的优势。国内外有多篇文献报道了关于在组织学、病理学、药理学、中医学等多个领域中使用显微拉曼光谱和超光谱成像技术区分各种组织和细胞的成功先例。研究目的：1、研究周围神经感觉和运动神经纤维显微拉曼光谱的特征。2、研究Karnovsky-Roots染色对感觉和运动神经纤维拉曼光谱的影响。3、评价使用显微拉曼光谱技术对经Karnovsky-Roots染色处理30分钟的脊髓前根和后根神经纤维进行快速鉴别的可靠性和可行性。4、研究周围神经束断面分子超光谱成像的表现。5、通过计算机数据处理和组织生化方法辅助,探讨超光谱技术识别周围神经显微结构的可行性。研究方法：1、取新西兰大白兔20只,每次10只分2次取材。分别取其双侧骶1脊髓前根和后根制备成纯运动神经或感觉神经纤维的兔周围神经标本,共80例；另取1例临床因非缺血坏死性疾病致膝上截肢的人腓总神经标本,切成5段。标本于-80℃冷冻贮存,实验时取出在-20℃下制作冰冻切片,拉曼光谱实验使用厚度为30μm的兔神经切片,超光谱成像实验使用厚度为10μm的兔和人神经切片。2、随机各选取10例脊髓前根和脊髓后根标本切片进行显微拉曼光谱扫描,获取周围神经纤维的拉曼光谱,并对其峰值和峰值比值进行统计学分析。3、随机各选取3例脊髓前根和脊髓后根标本切片,每例作4张连续切片,直接采集拉曼光谱数据,再随机各将各标本连续切片分别归入4组之一,进行Karnovsky-Roots组染色8小时、30分钟,以及0.1M碘化硫代乙酰胆碱溶液或0.05%新斯的明注射液浸泡孵育8小时处理,之后再次行拉曼光谱扫描,研究不同试剂处理后对原始神经纤维拉曼光谱的修饰效果。4、选取各20例脊髓前根和脊髓后根标本切片,进行Karnovsky-Roots染色30分钟后采集拉曼光谱,统计归纳经快速染色的脊髓前根拉曼光谱的变化规律。5、选取第二次取材的各20例脊髓前根和后根标本切片,Karnovsky-Roots染色30分钟后进行拉曼光谱采集,统计评价该方法快速识别周围神经纤维功能性质的效果。6、随机选取各3例兔脊髓前根和脊髓后根标本及3例人腓总神经标本切片进行分子超光谱成像,每张切片在x20和x40下按所需观察结构每次圈取15个感兴趣区域,计算得到周围神经束断面各显微结构的特征性光谱曲线。7、计算机处理数据,在ENVI中使用光谱角匹配法识别周围神经断面的髓鞘,并生成伪彩色图像用于直观观察。8、随机选取3例兔运动神经纤维和感觉神经纤维标本切片Karnovsky-Roots染色后进行分子超光谱成像,每张切片按所需观察结构每次圈取15个感兴趣区域,探讨染色对功能束纤维光谱曲线的影响。结果：1、周围神经纤维在550cm-1、1080cm-1、1110cm-1、1280cm-1、1440cm-1、1660cm-1附近表现出强度明显的拉曼强度,而其中一般以1440cm-1处的强度为最高。运动神经纤维与感觉神经纤维的拉曼光谱之间没有显著差异。2、Karnovsky-Roots染色8小时后运动神经纤维在原有峰位以外的480cm-1、510cm-1、595cm-1、2110cm-1、2155cm-1处有很强的拉曼强度；染色30分钟时各峰较8小时染色时弱但在2100cm-1-2160cm-1仍明显；感觉神经纤维拉曼光谱与染色前相同。染色30分钟后运动神经与感觉神经纤维I2100/I1440存在统计学差异(P<0.001)；12100/I1440>0.2可认为染色阳性。3、使用显微拉曼光谱联合Karnovsky-Roots染色30分钟的方法对脊髓前根和后根各20例进行识别,20根脊髓前根全部正确识别,19根脊髓后根正确识别,1根脊髓后根被错误认为是运动神经纤维。4、在超光谱成像下,周围神经轴突及髓鞘具有各自特征性光谱曲线。标本物种和放大倍数对曲线趋势无明显影响。运动神经与感觉神经纤维的光谱曲线趋势一致。5、使用光谱角匹配法,α=0.10时可以直接将神经束断面中的髓鞘结构识别并通过伪彩色图像表现。使用该法不能直接对神经功能束中神经纤维进行识别,即使染色后进行识别仍在可重复性上有所欠缺。结论：1、周围神经运动与感觉神经纤维的显微拉曼光谱近似,难以直接区分。2、显微拉曼光谱能够对经Karnovsky-Roots染色处理30分钟的脊髓前根和后根神经纤维进行快速鉴别。在本研究中,截断点为I2100/1,440=0.2,当高于该值时认为染色阳性。该方法对运动神经的识别灵敏度100%,特异度95%,准确度97.5%。3、周围神经中髓鞘在超光谱成像后其光谱曲线与其它结构的曲线明显不同,可使用光谱角匹配法鉴别,并通过伪彩色图像表现。4、使用分子超光谱成像技术不能直接对神经功能束中神经纤维进行识别,即使染色后进行识别仍在可重复性上有所欠缺,需要进一步研究和实验。
【作者】徐沁同；
【导师】张键；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】周围神经；拉曼光谱；分子超光谱成像；功能性质；显微结构；快速识别；

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