雌激素对海马神经元痫样放电及大鼠癫痫发作的影响及机制研究和培养基酚红最佳浓度的探讨

【摘要】癫痫是一种常见的中枢神经系统疾病,诱发因素繁多,发病机制至今尚未完全阐明。在临床工作中,部分女性患者的癫痫发作具有与其月经周期密切相关的特点,在特定的月经时相发作频繁且药物治疗效果欠佳,称之为经期癫痫。目前认为这种类型的癫痫与体内雌激素浓度改变密切相关,但雌激素在经期癫痫中所扮演的角色极具争议性,既显示出促癫痫发作的作用,同时也存在抑制癫痫的证据。根据各家之长我们大胆猜测：雌激素对癫痫的发作具有双向调节作用,其作用剂量可能就是关键性因素。那么究竟雌激素的浓度变化到怎样的程度会引起癫痫发作的改变呢?这样的变化是否能够在细胞学上找到直观的证据呢?于是我们将实验设计的重点直接放在了体外培养海马神经元的细胞膜动作电位的变化上。作为培养环境pH指示剂的酚红,具有一定的模拟雌激素生物活性的作用,其是否也可以影响神经元电活动,这种影响可以直接忽略不计吗?一直以来我们习以为常使用的pH指示剂是否具有其他的功能?当有具体的研究要求时何为最佳的酚红浓度?海马组织是癫痫发病的关键结构,海马神经元的异常放电之于癫痫犹如窦房结之于心脏般会产生生物放电的级联反应。那么雌激素浓度的改变对于海马神经元的异常放电会有怎样的作用呢?这种作用是如何表现的又有怎样的影响呢?是否通过常见的激素-受体机制发挥了生物学效应呢?为解答这种种的疑问,我们展开了大量的细胞电生理实验,以期能够为这样关键性的问题提供一些解答的方向。第一部分：培养基pH指示剂酚红最佳浓度的探讨目的：研究酚红对培养海马神经元异常放电的作用及其机制。方法：体外培养海马神经元,分别给予不同浓度的酚红(0,10,21.5,30,60,100,200μM)与神经元共同孵育14天,使用电生理膜片钳技术记录神经元自发动作电位；30μM酚红与雌激素非特异性受体拮抗剂ICI182780,与神经元共同孵育14天,使用电生理膜片钳技术记录神经元自发动作电位。结果：神经元异常放电比例(痫样放电神经元／记录神经元总数,下同)：0M(84%,16/19);10μm(60%,12/20)；21.5μM(21%,5/24)；30μM(9.5%,2/21)；60μM(43%,3/7)；100μM(53%,9/17)；200μM(83%,10/12).30μM组神经元异常放电比例相对于0、10、60、100、200μM各组明显降低(p<0.01)。神经元异常放电频率：0μM(0.024±0.005Hz,n=19)；10μM(0.006±0.002Hz,n=20)；21.5μM(0.007±0.003Hz,n=24)；30μM(0.001±0.001Hz,n=21)；60μM(0.015±0.008Hz,n=7)；100μM(0.01±0.004Hz,n=17)；200μM(0.028±0.011Hz,n=12).30μM组神经元异常放电频率相对于0、10、21.5、60、100、200μM各组明显降低(p<0.01)。当30μM酚红与ICI182780共同孵育14天后,30μM组神经元异常放电比例及频率为(9.5%:0.001±0.001Hz),ICI182780组神经元异常放电比例及频率为(80%:0.024±0.006Hz)。ICI182780组神经元异常放电比例及频率较30μM组明显增高(p<0.01)。结论：酚红对培养海马神经元的异常痫样放电同样具有剂量依赖性U-形调节作用,且30μM酚红对培养神经元异常痫样放电的抑制作用是通过雌激素受体实现的。第二部分：雌激素及其亚受体在培养海马神经元中的作用及其机制研究目的：从细胞模型出发,研究雌激素及其亚受体在神经元异常放电中的作用及机制。方法：1.体外培养海马神经元,经过14天神经元发育成熟后,给予不同剂量的雌激素(0.1,0.3,1ng/ml)以及酒精溶剂(0.002%)作为对照,与神经元共孵育3天,使用电生理膜片钳技术,记录神经元自发动作电位。2.自体外培养海马神经元第一天开始,给予不同浓度的雌激素(0.03,0.1,0.3,1ng/ml)及酒精溶剂(0.002%)对照,与神经元共孵育14天后记录神经元自发动作电位。3.自培养第一天开始,将雌激素0.1ng/ml分别与不同浓度的雌激素受体拮抗剂MPP-D(ERa受体拮抗剂)(100,10,1nM)以及PHTPP(ERβ受体拮抗剂)(100,10,1nM)共同作用,14天后记录神经元自发动作电位。4.自培养第一天开始,将雌激素1ng/ml分别与雌激素受体拮抗剂MPP-D(100nM)以及PHTTPP(100nM)共同作用,14天后记录神经元自发动作电位。结果：1.海马神经元培养14天后,酒精及不同浓度雌激素处理3天,神经元异常放电比例：酒精组(73%,22/30);雌激素0.1ng/ml(13%,3/23)；0.3ng/ml(37%,11/30)；1ng/ml(65%,13/20).0.1ng/ml组相对酒精组、1ng/ml组明显抑制神经元异常放电比例(p<0.01)。神经元异常放电频率：酒精组(0.019±0.005Hz,n=30)；雌激素0.1ng/ml(0.007±0.007Hz,n=23)；0.3ng/ml(0.0079±0.003Hz,n=30)；1ng/ml(0.037±0.016Hz,n=20).0.1ng/ml组相对酒精组、1ng/mL组明显抑制神经元异常放电频率(p<0.01)。2.酒精及不同剂量雌激素作用于培养神经元14天,神经元异常放电比例：酒精组(80%,12/15)；雌激素0.03ng/ml(47%,8/17)；0.1ng/ml(24%,4/17);0.3ng/ml(56%,15/27);1ng/ml(94%,15/16).0.1ng/ml组相对其余各组明显抑制神经元异常放电比例(p<0.01)。神经元异常放电频率：酒精组(0.016±0.003Hz,n=15)；雌激素0.03ng/ml(0.04±0.018Hz,n=17);0.1ng/ml(0.004±0.002Hz,n=17)；0.3ng/ml(0.01±0.004Hz,n=27)；1ng/ml(0.034±0.007Hz,n=16)。雌激素0.1ng/ml组相对酒精组、0.03ng/ml、1ng/ml组明显抑制神经元异常放电频率(p<0.01)。3.0.lng/ml组雌激素,分别与不同浓度的MPP-D(100,10,1nM)以及PHTPP(100,10,1nM)共同作用于培养海马神经元,当100nM的MPP-D及PHTPP分别与0.1ng/ml雌激素作用,MPP-D组及PHTPP组神经元异常放电比例及频率无差异(MPP-D:80%,0.046±0.011Hz;PHTPP:89%,0.069±0.016Hz),较雌激素组(24%,0.004±0.002Hz)明显升高(p<0.01)。当MPP-D及PHTPP浓度为10nM时,MPP-D组神经元放电比例及频率(14%,0.004±0.004Hz)与雌激素组(24%,0.004±0.002Hz)无变化,而PHTPP组神经元放电比例及频率(83%,0.025±0.009Hz)较雌激素组明显升高(p<0.01)。当MPP-D及PHTPP浓度为1nM时,MPP-D组神经元放电比例及频率(11%,0.003±0.002Hz)与雌激素组(24%,0.004±0.002Hz)无变化,而PHTPP组神经元放电比例及频率(67%,0.052±0.029Hz)较雌激素组明显升高(p<0.01)。4.1ng/ml雌激素,分别与MPP-D(100nM)以及PHTPP(100nM)共同作用于培养海马神经元,实验结果显示,MPP-D组神经元放电比例及频率(20%,0.003±0.002Hz)明显低于1ng/ml雌激素组(94%,0.034±0.007Hz)(p<0.01),而PHTPP组神经元放电比例及频率(80%,0.04±0.015Hz)与1ng/ml雌激素组相比无变化。结论:不论是雌激素短期作用(3天),还是长期作用(14天),雌激素对神经元异常痫样放电的比例及频率都具有剂量依赖性U-形调节作用,既具有抑制神经元异常痫样放电,也存在促进神经元异常痫样放电的作用,0.1ng/ml作用剂量是关键性的转折点。雌激素不同的亚受体在神经元异常痫样放电中具有不同的作用,ERa对神经元异常痫样放电起到促进作用,而ERβ则起到抑制性作用。第三部分雌激素对大鼠癫痫发作的影响及其机制研究目的：从癫痫动物模型出发,研究雌激素及其亚受体在至痫大鼠行为学中的作用及机制。方法：1.成年雌性SD大鼠阴道涂片确定有2个正常生理周期后行双侧卵巢摘除,术后饲养1周予以侧脑室埋管,埋管后一周随机分为去势埋管对照组,雌激素组(侧脑室注射雌激素0.75ng×3天),与雄性大鼠组及动情期大鼠组均使用PTZ(40mg/kg)至痫。根据Racine分级标准,观察至痫后大鼠发作行为。2.成年雌性SD大鼠侧脑室埋管,一周后随机分为MPP-D组以及PHTPP组,分别侧脑室注射MPP-D(100nM)和PHTPP(100nM)大于3天,比较动情期大鼠癫痫发作。结果：1.雄鼠,去势雌鼠,动情期雌鼠以及去势十雌激素(0.75ng×3天)组行为学评分分别为：3.5±1.0(n=10),0.143±0.143(n=7),5.4±1.0(n=9),4.7±0.8(n=7)。去势雌鼠发作强度较其余各组明显降低(p<0.01)。2.动情期组,动情期+MPPD组以及动情期+PHTPP组行为学评分分别为：5.4±1.0(n=9),1.9±1.1(n=8),3.1±1(n=8)。动情期+MPP-D组较动情期组大鼠癫痫发作强度明显下降(p<0.05)。结论：动物学实验结果提示,雌激素对癫痫发作具有调节作用,其中ERβ可能起到抑制癫痫发作的作用。结论1.酚红对培养神经元的异常痫样放电具有剂量依赖性U-形调节作用,这种抑制作用是通过雌激素受体实现的。目前培养基中的酚红浓度并非培养神经元的最佳浓度。2.体外培养海马神经元,无论是短期作用(3天),还是长期作用(14天),雌激素均显示出对培养海马神经元异常痫样放电的剂量依赖性U-形调节作用。3.雌激素不同亚受体,在培养海马神经元异常痫样放电中起到不同的作用,ERa对神经元异常痫样放电具有促进作用,ERp则具有抑制性作用。4.动物学实验显示,雌激素对大鼠癫痫行为表现出剂量依赖性影响,ERp可能具有抑制癫痫发作的作用。
【作者】刘旭；
【导师】汪昕；
【作者基本信息】复旦大学，神经病学，2012，博士
【关键词】癫痫；雌激素；ERα；ERβ；酚红；

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