基于同源转基因的FLC转基因芥菜的获得

【摘要】随着基因工程在各领域的广泛应用,许多转基因植物和产品已进入商品化阶段,转基因的安全问题也引起了公众日益激烈的讨论。对此,研究者们对转基因安全性评价和应对策略研究也越加重视。培育无选择标记基因(marker-free)的转基因植物便是安全转基因策略的一种。标记基因主要用于在遗传转化过程中植株的筛选鉴定,对植物生长并非必要的,而且标记基因的存在还可能造成一些安全性问题。利用位点特异性重组系统可以实现标记基因的高效删除。同源转基因技术是近几年提出的一个有效的安全转基因策略。所谓同源转基因,即获得的转基因植株体内无任何外源基因的导入,所有转基因元件均来自植物本身或能与之杂交的近缘种或野生种。由于同源转基因与传统育种的基因来源相同,因此理论上可以认为同源转基因植物与传统育种育成的品种一样安全。另外,同源转基因技术还可避免传统育种中的连锁累赘,加快育种进程,具有广阔的应用前景。同源转基因技术可广泛应用于作物的抗性与品质改良,目前,在苹果与马铃薯的抗病育种中已有报道,但在蔬菜作物中鲜有报道。本研究以十字花科芸薹属作物芥菜(BrassicajunceaCoss.)为研究对象,以开花抑制基因FLC作为目的基因,结合同源转基因技术和Cre/lox位点特异性重组系统介导的无标记基因策略,获得同源转基因FLC芥菜植株。本文旨在探讨同源转基因技术的可行性,同时,为芥菜等十字花科蔬菜的分子育种工作提供了一条种安全便捷的新途径。本研究获得的结果如下：1、植物表达载体的构建首先,从油菜基因组DNA中克隆出Rbcs2启动子、BnPro启动子、RbcsT终止子；其次,分别构建了以GUS基因为报告基因的同源基因Rbcs2、BnPro、RbcsT的表达载体(pCARbcs2GUS、pCABnGUS、pCA35SGUSRT);最后,构建了四个同源转基因FLC芥菜最终表达载体(Rn、RH、Bn、BH).在这四个载体中,由Rbcs2启动子或BnPro启动子驱动控制来自芥菜的FLC基因表达,Napin种子特异性启动子或HTR花粉特异性启动子控制Cre基因的表达,其中Bar标记基因表达框置于两个同向lox位点之间。2、转基因芥菜植株的获得以芥菜下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法转化所有表达载体,在含除草剂的筛选培养基上经过多代筛选,获得抗性植株。PCR鉴定结果表明各表达载体均获得大量转基因芥菜植株。3、pCARbcs2GUS、pCABnGUS、pCA35SGUSRT转基因植株的GUS活性分析为研究芥菜同源基因Rbcs2、BnPro、RbcsT的组织特异性表达情况,取相应的转基因植株的不同组织部位(如根、茎、叶、花、种子等)进行GUS染色,并对叶片中Rbcs2和BnPro启动子驱动的GUS基因表达活性进行定量分析,以35S启动子驱动的GUS基因表达活性为对照。就GUS组织化学染色结果来看,Rbcs2启动子主要在植株绿色组织部位表达；BnPro启动子与35S启动子一样属于组成型启动子,在芥菜植株各个部位均有表达；同时RbcsT终止子的功能也得到了验证。就叶片GUS表达活性而言,35S启动子的GUS活性表达量最大,其次是Rbcs2启动子,最后是BnPro启动子。4、同源转基因FLC芥菜标记基因的删除获得的同源转基因FLC芥菜(Rn、RH、Bn和BH)中,由种子特异性启动子Napin和花粉特异性启动子HTR控制Cre基因的表达,导致Bar基因及Cre表达框被重组删除。T1代转基因植株除草剂处理结果显示,四种T1代同源转基因FLC芥菜在喷洒了除草剂后,植株叶片逐渐黄化卷曲,处理三次后大部分植株整株萎蔫死亡。根据植株对除草剂的抗性分析标记基因的删除效率,结果表明,Rn和Bn转基因植株中由种子特异性启动子Napin介导的Cre/lox重组系统的删除效率达100%,高于RH和BH植株中由花粉特异性启动子HTR介导的Cre/lox系统92.34%和93.75%的删除效率。5、同源转基因FLC芥菜的获得对Rn、RH、Bn和BH的T1代同源转基因FLC芥菜进行PCR鉴定和除草剂抗性验证。PCR扩增结果显示获得了6株Rn、1株RH、3株Bn和2株BH的同源转基因FLC芥菜。这些植株可检测到同源转基因元件,且未检测到Cre和Bar基因表达框。另外,有2株Rn和2株Bn转基因植株既检测到同源转基因元件,也检测到Cre和Bar基因表达框,表明这4个转基因植株可能是因Cre基因不完全表达而导致删除不彻底的嵌合体植株。而进一步的除草剂抗性验证结果与PCR结果一致。
【作者】张茜；
【导师】宋洪元；
【作者基本信息】西南大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】芥菜；同源转基因；FLC；Cre/lox位点特异性重组系统；

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