黑桑抗氧化成分的分离纯化及活性研究

【摘要】黑桑是国内唯一的22倍体桑种,是新疆地区特有的黑桑种质资源,其不同的染色体倍数和恶劣的生态环境导致其生物学特征特性、各种营养素及其次生代谢产物都有别于其它桑种,对其体内的化学成分研究,有利于进一步生理生化、抗逆机理等的研究和开发利用。细胞正常代谢过程中会产生大量自由基,从而引起机体的衰老,因此,寻找天然、低毒的抗氧化剂成为了目前研发抗衰老功能性食品和药品的一个重要部分。研究发现黑桑具有很好的清除自由基等抗氧化活性。国内外对其它桑种的化学成分的活性研究报道较多,但对新疆黑桑以寻求清除自由基等抗氧化活性成分的研究却鲜有报道。本论文在清除DPPH活性跟踪下,对黑桑进行了抗氧化活性及成分的研究,其内容及结果如下：1黑桑抗氧化活性部位的确定为了快速分离到抗氧化活性较强的化合物,首先从总多酚、总黄酮含量,DPPH.OH的清除能力和还原能力方面对桑树器官(枝条、叶片)进行了抗氧化活性的筛选,结果表明黑桑枝条和叶片醇提物之间具有明显差异(p<0.01)。枝条的多酚与黄酮总质量比(170.49±1.68mg/g)显著高于叶片(31.96±0.73mg/g)；枝条清除DPPH自由基、OH自由基的能力(IC50分别为0.52±0.03mg/mL、0.59±0.06mg/mL)远远强于叶片(IC50分别为0.95±0.01mg/mL.1.17±0.03mg/mL)；桑枝的总还原能力(Vc当量为58.25±0.04mg/g)也强于桑叶(Vc当量为25.33±1.22mg/g)。因此,本研究选择黑桑枝条作为进一步抗氧化研究的材料。用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水对枝条醇提物进行了萃取分段,并对各分段进行了总多酚和总黄酮含量的检测,各组分的得率分别为2.85%、27.81%、36.63%和31.02%,总多酚、总黄酮的总质量比分别为211.75±0.08mg/g.764.27±1.41mg/g.137.66±1.53mg/g和120.18±1.20mg/g,各组分间具有极显著差异(p<0.01),这表明石油醚和乙酸乙酯萃取组分的抗氧化活性成分含量最高。运用薄层色谱(TLC)—自显影技术检测桑枝醇提物萃取组分的自由基清除活性,结果显示：桑枝醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分相对于正丁醇和水部分,薄层板的紫色背景下具有明显的黄白色斑点,可以判断测试样品中以石油醚组分和乙酸乙酯组分清除DPPH自由基的活性最强,进而对各萃取组分进行了抗氧化活性测试,结果显示：清除DPPH自由基和OH自由基能力的关系为：乙酸乙酯萃取组分>石油醚萃取组分>正丁醇萃取组分>剩余水相组分,多酚与黄酮的总量与清除DPPH和OH自由基的能力呈正相关,乙酸乙酯组分清除DPPH自由基的能力与其它组分间具有极显著差异(p<0.01),清除OH自由基的能力与正丁醇和剩余水相组分差异极显著(p<0.01);总还原能力的关系为：乙酸乙酯组分>正丁醇组分>剩余水相>石油醚组分,各组分之间差异极显著(p<0.01)。因此,确定首先从石油醚与乙酸乙酯分段中进行抗氧化活性成分的分离鉴定。2DPPH清除活性跟踪下的抗氧化活性成分的分离应用硅胶、SephadexLH-20凝胶柱色谱以及重结晶等分离技术,对石油醚和乙酸乙酯萃取组分中抗氧化活性成分进行分离。本研究建立了一套适用于桑树抗氧化活性成分的快速检测及跟踪分离方法,即TLC-自显影技术清除DPPH自由基活性、分离纯化相结合的分离方法。该方法能简洁、快速地从黑桑枝条成千上万种化合物中分离出具有抗氧化的目标化合物。从18.41g的石油醚分段中分离得到2个化合物,从175.00g乙酸乙酯分段中分离得到9个化合物,运用TLC-自显影技术、显色反应、核磁共振仪等对这11个化合物进行了理化性质分析、光谱测定及结构解析,确定了其中6个化合物的结构,分别是a-linolenicacid(MN1,脂肪酸,31mg),uvaol(MN2,三萜,16mg),sanggenonM(MN3,黄酮,29mg),sanggenonA(MN4,黄酮,18mg),β-monostearin(MN5,甘油酯,37mg),isoscopoletin(MN6,香豆素,13mg)。5个结构未确定的化合物中有2个(MN7:6mg,MN10:9mg)可能为甾醇类化合物,1个(MN8:7mg)可能为黄酮类化合物,1个(MN9:6mg)可能为木质素类化合物,1个(MN11:5mg)可能为香豆素类化合物。上述化合物涵盖了脂肪酸、三萜、黄酮、甘油酯、香豆素、木质素、甾醇类化合物,化合物a-linolenicacid和isoscopoletin为首次从黑桑枝条中分离得到,其中isoscopoletin为新疆黑桑的抗炎活性物质之一。3黑桑单体化合物抗氧化活性测试将分离得到的各单体化合物,以BHT为对照,测定其对DPPH.OH的清除作用和还原能力,结果表明：α-linolenicacid(MN1,DPPH:IC50=26.04±0.04μg/mL,OH:39.47±0.08μg/mL)、sanggenonM(MN3,DPPH:IC50=39.87±0.05μg/mL,OH:57.21±0.09μg/mL)、黄酮(MN8,DPPH:IC50=45.63±0.07μg/mL,OH:59.46±0.04μg/mL)、sanggenonA(MN4,DPPH:IC50=54.54±0.03μg/mL,OH:IC50=80.13±0.02μg/mL)、木质素(MN9,DPPH:IC50=57.82±0.02μg/mL,OH:IC50=99.92±0.05μg/mL和isoscopoletin(MN6,DPPH:IC50=61.56±0.07μg/mL,OH:100.20±0.01μg/mL)在总还原力、清除DPPH和OH自由基的能力明显强于对照BHT,各化合物间对DPPH和OH自由基的清除能力具有极显著差异(p<0.01),通过本次研究,从黑桑中寻找到了系列具有很好的清除自由基活性的抗氧化活性成分,这为新疆黑桑的进一步研究和开发利用奠定了基础。
【作者】刘静；
【导师】徐立；
【作者基本信息】西南大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】黑桑；分离纯化；DPPH；抗氧化活性；

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