桑疫病原菌拮抗性桑树内生菌的筛选鉴定及其抑菌活性物质研究

【摘要】桑疫病是由丁香假单胞菌桑致病性变种(Pseudomonassyringaepv.mori)引起的桑细菌性疾病。根据发病症状可将桑疫病分为断柄型、缩叶型、黑枯型,该病在全国各桑树栽培地区普遍发生,给蚕农带来极大的经济损失。目前,桑疫病的防治主要依赖化学农药,然而化学农药不仅造成环境污染,同时农药残留给养蚕业带来的负面影响也日益凸显。利用桑树内生菌进行桑疫病的生物防治是近年来备受关注的植病防治新策略,它可以减少桑树病害,促进蚕桑产业发展,并能与环境和谐相处。本研究从健康桑树中筛选、鉴定对桑疫病菌拮抗作用稳定而显著的内生菌。优化生防内生菌产生抑菌活性物质的发酵条件,分离纯化活性发酵液中的主要抑菌活性成分,为利用桑树内生菌进行桑树病害的生物防治及抑菌机制的深入探究奠定前期研究基础,本研究主要取得了以下研究结果：1.内生拮抗菌的分离、筛选及鉴定从健康桑树(桐乡青)中分离获得77个内生菌分离株,其中SWg2菌株对桑疫病菌表现出强而稳定的拮抗作用。该菌株经传代10次后,其发酵上清液仍然表现出很强的抑菌效果。对菌株进行了形态学特征观察、生理生化试验及基于16SrRNA的系统发育分析。结果显示,SWg2菌株在PDA培养基上菌落呈乳白色,边缘光滑整齐,革兰氏染色为阴性,不具有芽孢,氧化酶试验、产H2S试验和亚硝酸盐产气试验都呈阴性反应,能利用麦芽糖、果糖,不能利用乳糖和淀粉,葡萄糖发酵试验(OF)表现为发酵型,该菌株可氧化分解多种单糖、多糖,并可利用其作为唯一的碳源；16SrRNA基因序列分析显示SWg2菌株与成团泛菌同源性达到98%以上,系统发育分析结果表明其与已知菌株PantoeaagglomeransATCC27993(FJ611872)处于同一最小分枝。综合上述检测结果,将桑树内生拮抗菌SWg2鉴定为成团泛菌(P.agglomerans),命名为成团泛菌SWg2。2.内生拮抗菌SWg2菌株发酵条件优化利用单因素实验与正交实验对SWg2菌株发酵条件进行优化,结果表明成团泛菌SWg2产抑菌活性物质发酵培养基的最佳碳源为甘油,氮源为NH4NO3,金属离子为Mg2+,磷酸盐为KH2PO4,发酵培养基起始pH为7.5,装瓶量为20%,培养温度为28℃,转速为170r/min,种子液接种量为4.00%,培养时间为5d。正交试验结果表明发酵培养基最优组合为2.00%的甘油、2.00%的(NH4)2SO4、0.10%的KH2PO4和0.15%的MgS04·7H2O。与马铃薯葡萄糖培养基和牛肉膏蛋白胨培养基相比,利用优化后发酵培养基发酵生产的等量发酵上清液,其抑菌圈直径分别提高了186.82%和215.18%。通过发酵条件优化显著提高了成团泛菌SWg2菌株抑菌活性物质的产量,为该菌株活性发酵液的大量生产及抑菌活性成分的分离纯化奠定了基础。3.抑菌抑菌活性物质的理化性质的探究及活性成分的分离纯化抑菌活性物质的理化性质研究表明：主要抑菌活性成分易溶于乙醇、甲醇和乙腈,不溶于正丁醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯及石油醚等有机溶剂；抑菌成分具有很好的热稳定性,活性发酵液经100℃处理30min后其抑菌活性未发生显著变化；在pH3-6的环境中发酵上清液抑菌活性稳定,当pH值高于6时,其抑菌活性急剧下降,pH>9时抑菌活性物质完全失活。基于对抑菌活性成分理化性质的掌握,设计纯化方案,进行抑菌活性物质的分离纯化。本研究首先利用无水乙醇沉淀去除发酵上清液中的杂蛋白,再将上清液浓缩为浸膏,乙腈浸提浸膏中抑菌活性成分后旋转蒸发除去乙腈,提取物溶于pH5.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。粗提物经DEAEsepharosefastflow阴离子交换层析纯化,在盐离子浓度大约在0.13M-0.15M处收集到主要抑菌活性成分。对发酵液上清液、乙腈浸提物以及离子交换分离获得活性组分的最低抑制浓度(MIC)的检测结果表明其分别为3.30×104μg/mL、6.20×103μg/mL和2.37×102μg/mL,经离子交换层析以后,抑菌活性物质被纯化了70余倍。将离子交换层析收集活性组分经高效液相色谱C18柱纯化,以0.1%的乙酸和100%的乙腈为流动相进行梯度洗脱,在保留时间为6.27min时收集到抑菌活性成分的单峰。抑菌活性成分的分离纯化为后续抑菌机理的研究奠定了基础。
【作者】张飞官；
【导师】谢洁；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】桑疫病；桑树内生菌；生物防治；发酵优化；分离纯化；

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