大肠上皮细胞癌变过程中相关microRNA的靶基因筛选验证及miR-424的机制研究

【摘要】大肠癌(Colorectaladenocarcinoma,CRC)是人类消化系统最常见且主要的致死性肿瘤之一。大肠癌是一个多基因、多阶段、长期形成的复杂的病变过程。早发现、早诊断、早治疗对提高结直肠癌的存活率有显著的意义。因此,探索大肠癌早期病变及其演进过程中的分子机制显得尤为重要。近来,微小RNA(microRNA,miRNA)由于其在调控基因表达方面的重要作用,成为关注的焦点。microRNA(miRNA)是一类长度在18-25个核苷酸的内源性非编码的单链RNA分子,通过与靶基因的mRNA3’UTR区域配对调控基因的表达进而发挥生物学功能。研究表明,miRNAs广泛存表达于各个物种和组织中,并参与调节细胞生长发育、分化、凋亡并影响肿瘤的生长。一些研究证实miRNA具有癌基因或抑癌基因样作用,可直接参与人类肿瘤(如肺癌、乳腺癌、颅脑肿瘤、肝癌、结直肠癌及淋巴瘤等)的形成,是肿瘤发生、发展过程中重要分子。研究表明,在大肠癌中差异表达的miRNA均可通过作用于肿瘤相关的靶基因来调控肿瘤的发生和发展。然而,对于其中绝大部分miRNA,它们作用的靶基因以及具体的生物学功能目前仍有待于进一步研究。本课题组前期研究通过激光捕获显微切割技术(Lasercapturemicrodissection,LCM)及Agilent芯片技术已经对225例大肠肿瘤各个阶段病变标本进行全基因组microRNA表达分析,我们发现有40个miRNA的表达在大肠粘膜上皮转化和演进的过程中存在显著差异。本研究首先筛选和验证出在大肠肿瘤转化和演进过程中与miRNA相关的靶基因,同时我们在临床大肠病变样本中通过原位杂交方法检测miR-424的表达,并进一步验证早期大肠癌中特异性表达的miR-424与目标靶基因的相关关系,探索miR-424的在大肠癌细胞株中的生物学行为,揭示miR-424在大肠癌发生过程中的生物学功能,为大肠癌的早期发生提供分子理论依据,并为其诊断和治疗提供新的靶点。第一部分大肠肿瘤转化和演进过程中与microRNA相关靶基因的初步筛选目的：预测并筛选与大肠肿瘤转化和演进相关作用通路中的候选miRNA的目标靶基因。方法：通过miRecords数据库对上述40个miRNA进行靶基因mRNA的预测(整合了至少4个靶基因预测软件)。结合上述大肠癌信号通路上的关键蛋白,根据KEGG信号通路数据库对靶基因mRNA进一步加以筛选。在59例人冰冻大肠组织中(包括18例正常大肠上皮组织,19例大肠腺瘤组织,22例Dukes’A和Dukes’B期大肠腺癌组织),应用荧光实时定量RT-PCR方法检测上述靶基因mRNA的表达水平及其相应miRNA的表达水平。使用校正t检验和差异倍数超过2倍的筛选条件以miRNA-mRNA表达呈负向关系的规律,筛选进一步待功能研究的靶基因。结果：通过miRecords数据库靶点预测以及KEGG数据库比对后发现,其中27个microRNA的靶基因涉及大肠肿瘤转化和演进过程中关键的信号通路,相关的靶基因共58个。这些mRNA所翻译表达的蛋白主要涉及Wnt、TGF-beta、MAPK、p53等重要信号通路。经qRT-PCR检测发现,20个mRNA的表达在不同组织中存在显著差异(t检验,p<0.05),且其表达从正常肠上皮到腺瘤直至Dukes’A/B期腺癌均呈降低趋势。其中13个mRNA的表达与其相对应的8个miRNA(miR-135b、miR-182、miR-183、miR-34a、miR-424、miR-552、miR-769-5p和miR-96)的芯片表达结果呈负相关。经qRT-PCR进一步验证发现,5个miRNA(miR-135b、miR-182、miR-183、miR-424、和miR-96)与9个mRNA(NODAL、SMAD4、MET、CYCS、PDGFRA、MAP2K1、SMAD3、MAP2K4和WNT7A)存在负相关关系。并且miR-424的表达水平在肠腺瘤至Dukes’A/B期肠腺癌存在显著差异(p<0.001),上调倍数较其他miRNA高,约为3.12倍。结论：大肠癌信号通路中关键蛋白相对应的mRNA表达在不同阶段病变的大肠组织中存在显著差异,其中一些mRNA的表达与其相对应的miRNA表达呈负相关。miRecords和KEGG数据库为microRNA靶基因的预测提供了很好的途径,在组织水平上可以筛选待进一步功能研究的靶基因。miR-424在肠腺瘤与Dukes’A/B期肠腺癌显著差异表达引起我们的关注。第二部分原位杂交分析miR-424在早期结直肠癌及癌前病变中的表达目的：原位杂交实验检测miR-424在正常肠上皮、肠腺瘤(低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变)与早期大肠癌的表达水平。方法：在30例石蜡包埋结直肠切除手术样本中(包括7例低级别上皮内瘤变组织,8例高级别上皮内瘤变,15例Dukes’A和Dukes’B期大肠腺癌组织及各自旁的正常组织以供对照研究),使用原位杂交方法检测miR-424的表达情况。结合CRi-Nuance多光谱显微影像系统的光谱检测技术和inForm软件,对miR-424在结直肠病例组织中的表达范围、浆阳性强度行定量分析。结果：肠腺瘤和早期大肠癌中miR-424在细胞浆中的平均表达面积比正常肠组织大。Dukes’A/B期大肠癌与癌旁正常组织之间(△=1.16)、高级别上皮内瘤变与旁正常组织之间(A=1.56)、低级别上皮内瘤变与旁正常组织之间(Δ=1.56)以及癌旁正常组织与高级别上皮内瘤变旁正常组织之间(Δ=1.32)等组合中miR-424于细胞浆中的表达范围明显扩大(p<0.05)；Dukes’A/B期大肠癌比癌旁正常组织(Δ=1.63)及低级别上皮内瘤变(A=1.34)；高级别上皮内瘤变比低级别上皮内瘤变(Δ=1.29)中miR-424在细胞浆阳性表达的强度比例升高(p<0.05)。结论：利用多光谱成像系统能有效的定量检测miR-424的杂交信号,并证实miR-424在早期肠腺癌及癌旁组织、早期肠腺癌与低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间,以及在高级别上皮内瘤变与早期大肠癌的肿瘤旁正常组织间显示出一定的表达差异,但miR-424在早期肠腺癌与高级别上皮内瘤变之间的表达未见显著差异。第三部分：鉴定miR-424候选靶基因及具体生物学功能目的：细胞水平验证miR-424与其候选靶基因的相互关系,并探讨miR-424在结肠癌DLDl细胞中生物学功能。方法：构建稳定高表达miR-424的人结肠癌DLD1细胞株。运用qRT-PCR,荧光素报告基因检测系统和Western-blot方法检测miR-424直接调控的靶基因。采用CCK8实验、Transwell侵袭及迁移实验检测miR-424对人结肠癌DLD1细胞的生长、侵袭转移能力。结果：荧光素报告基因系统检测结果显示,miR-424能抑制MAP2K1、SMAD3和WNT7A荧光素酶活性。Real-timeRT-PCR和Western-blot方法检测结果显示,miR-424能够抑制SMAD3和WNT7A的蛋白表达,但是mRNA水平无明显差异。通过Transwell小室侵袭和迁移实验发现,稳定过表达miR-424的DLD1细胞侵袭和迁移能了均较对照组强,上调miR-424能够促进大肠癌细胞株的侵袭及迁移能力。CCK8实验结果显示上调DLD1细胞中miR-424的表达,对其增殖能力无显著影响。结论：miR-424能直接结合并作用于SMAD33’UTR和WNT7A3’UTR,并且参与SMAD3和WNT7A的蛋白表达的调节。miR-424可促进结肠癌细胞DLD1侵袭与迁移能力。
【作者】娜依玛·巴亚西；
【导师】朱虹光；
【作者基本信息】复旦大学，病理学，2013，博士
【关键词】早期大肠癌；腺瘤；癌前病变；发生；microRNA；miRNA；靶基因；mRNA；miR-424；原位杂交；增殖；侵袭；迁移；

【参考文献】
[1]段钱花.Ni基合金复合LaNi_5多孔电极的制备及其在碱性介质中析氢性能研究[D].华侨大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[2]胡趣.编组站仿真平台表示系统相关技术研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2014,硕士.
[3]杜强.1880-1949年豫南地区基督教研究[D].河北师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[4]王力.集团型钢铁企业集中管控信息化建设的探索与实践(上)[J].冶金自动化,2013,06:1-6.
[5]秦剑.我国快餐连锁企业品牌形象塑造研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[6]胡军峰.风电接入引致电网辅助服务成本分摊机制及模型研究[D].华北电力大学,技术经济及管理,2014,博士.
[7]金斌华.网络环境下的隐私权保护[D].华东政法学院,法律,2004,硕士.
[8]王亮.脂肪酶—固体酸耦合催化芳香仲醇的动态动力学拆分[D].浙江大学,生物化工,2013,硕士.
[9]张婷婷.燕麦乌冬面加工工艺与保质期的研究[D].内蒙古农业大学,食品加工与安全,2012,硕士.
[10]赵兵,祁宁.石墨烯和氧化石墨烯在纺织印染中的应用[J].印染,2014,05:49-52+59.
[11]徐翔.国有企业内部控制机制及运行研究[D].西南财经大学,财务管理,2014,博士.
[12]林书雄.以乙酰胆碱酯酶为靶标的虚拟筛选研究[D].华中师范大学,农药学,2013,硕士.
[13]李代晓.舒胃方治疗功能性消化不良作用机制的研究[D].承德医学院,中药学,2011,硕士.
[14]金鲁东.ControlNet与Ethernet/IP网络结构的应用研究[D].兰州理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[15]王建民.新型稀土镍基自熔性合金涂层高耐磨耐蚀性的研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[16]赵家庆,季侃,孙大雁,高宗和,丁宏恩,宋鑫.电网调度省地一体化试点工程关键技术方案[J].电力系统自动化,2012,23:120-125.
[17]洪雪娇.泉州中小企业融资问题探究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[18]王网琴.无人机群协同空战决策研究[D].南京航空航天大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[19]黄即.有机富镁合金涂层在盐雾环境下的腐蚀性能研究[D].内蒙古科技大学,材料学,2013,硕士.
[20]王娇.叶片固有特性和振动响应分析方法研究[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[21]施干卫.基于环境敏感的植物动态生长模型研究[D].浙江工业大学,2006.
[22]盛莉萍.我国农村社会救助研究[D].安徽大学,行政管理,2013,硕士.
[23]李周平.先秦两汉复仇现象比较研究[D].辽宁师范大学,专门史,2012,硕士.
[24]蔡红.建设高等教育强国视域下的大学教师发展研究[D].广西师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[25]史达鑫.一种基于信息流核心的复杂网络动态社区追踪方法[D].华中科技大学,控制工程,2013,硕士.
[26]周锐,成晓静,余舟毅,池沛,陈宗基.智能化战术飞行轨迹规划方法研究[J].控制与决策,2005,02:222-225.
[27]张怡之.儿童福利机构教师队伍建设研究[D].湖南师范大学,教育管理（专业学位）,2013,硕士.
[28]郑容.成都市锦江区社会管理创新研究[D].西南交通大学,公共管理,2013,硕士.
[29]王璐.鼻咽癌调强放疗分段计划中采用二段合成设计与独立设计第二程计划的剂量学比较[D].苏州大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[30]赵琳琳.我国保险电子商务发展策略研究[D].首都经济贸易大学,保险（专业学位）,2014,硕士.
[31]许维楼.苏州金龙客车生产计划系统研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[32]雷志球.基于ZigBee多智能车系统通信的设计与实现[D].华中师范大学,电路与系统,2013,硕士.
[33]李指南.目的论下美剧幽默语的字幕翻译研究[D].西北大学,英语语言文学,2013,硕士.
[34]陈九美.南阳丹江口库区不同土地利用类型表层土壤水文物理性质研究[D].河南农业大学,林业,2012,硕士.
[35]王举翠.驻济高校舞蹈专业学生的营养状况调查及营养配餐指导研究[D].山东体育学院,体育教学,2012,硕士.
[36]厉光烈,赵洪明.诺贝尔物理学奖百年回顾(续)[J].现代物理知识,2011,02:14-21.
[37]史青.8-烷基小檗碱衍生物降血脂活性及对肝脏LDLR表达的影响[D].西南大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[38]郝文涛.天津建工集团二建公司国家住宅产业化基地发展战略研究[D].天津大学,工商管理,2004,硕士.
[39]郭丽诗.活血化瘀法治疗原发性肝癌的系统评价及临床用药分析[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[40]黄成华.现代性道德危机及其重构维度[D].苏州大学,伦理学,2003,硕士.
[41]蒋天颖,华明浩,许强,王佳.区域创新与城市化耦合发展机制及其空间分异——以浙江省为例[J].经济地理,2014,06:25-32.
[42]李静.多元文化视域下外研社版《高级英语》文化内容评价[D].河北科技大学,英语语言文学,2013,硕士.
[43]朱冠胜.基于关键字检索的XML数据源选择[D].复旦大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[44]林弥.基于RT量子器件的数字电路设计[D].浙江大学,电路与系统,2004,硕士.
[45]成泽枫.中国基础养老金全国统筹问题研究[D].苏州大学,社会保障,2014,硕士.
[46]杨春亮.高性能沥青路面力学行为与结构设计研究[D].大连理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[47]何秋阳.房产税改革试点及前景分析[D].安徽大学,财政学,2013,硕士.
[48]方雯.随机Ising金融系统的价格波动研究[D].北京交通大学,运筹学与控制论,2014,博士.
[49]魏剑侠,魏清林.热箱法在建筑节能专项验收中的应用初探——用RX-11型传热系数检测仪测定[J].中国住宅设施.2003(02)
[50]易健翔.燃料电池活化仪监控系统的研究与设计[D].华中科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.