柠檬苦素合成关键基因citLGT转化柑橘的研究

【摘要】我国是世界最大的柑橘生产国,栽培面积和产量均居世界首位。近年来我国除了稳步提升柑橘罐头的生产和出口外,也在不断推进橙汁加工业的发展进程。目前在橙汁加工中仍存在一些难题需要克服,其中榨汁后出现的“延迟苦味”(delayedbitterness)司题是限制脐橙等橙汁加工业发展的一个重要因素。延迟苦味现象是由酶催化的柠碱等苦味物质的生物合成引起的。研究发现,柠檬苦酸A-环内酯(1imonoateA-ringlactone,LARL)是柠碱合成的直接前体,它在果实正常成熟过程中逐渐被柠檬苦素UDP-葡萄糖苷转移酶(1imonoidUDP-glycosyltransferases,LGTase)糖基化为配糖体(LG),而在果实受到机械损伤等外界环境胁迫时就会转化为具有强烈苦味的柠碱。因而,可以通过改变LARL在果实中的积累从而影响LARL向柠碱的转化,进一步影响后苦味形成。本实验从温州蜜柑中克隆了柠檬苦素UDP-葡萄糖苷转移酶基因citLGT,通过农杆菌介导的遗传转化调控其在转基因锦橙中的异位表达,为探讨该基因影响后苦味性状的分子机制和基因工程改良柑桔延迟苦味性状提供了新的思路和材料。取得的阶段性结果有以下几方面：1.柠檬苦素类似物糖基转移酶基因citLGT编码序列及RNAi功能序列的克隆根据前人的研究报道,设计特异引物,从温州蜜柑基因组中扩增获得citLGT基因编码序列；参考RNA干扰原理及RNAi载体构建策略,设计三对特异引物分别从citLGT基因不同位置扩增获得三段长分别为268bp、176bp和302bp特异性序列作为RNA干扰目的片段。2.组成型启动子(CaMV35S)控制的citLGT基因的超量表达和RNAi抑制表达载体的构建将citLGT基因克隆到载体pMD19-T上,三段RNAi干扰序列分别克隆到PGEM-T载体上,然后分别构建了citLGT基因的植物超量表达载体p35S：citLGT和三个RNAi抑制表达载体p35S:citLGT-RNAi-1、p35S:citLGT-RNAi-2p35S:citLGT-RNAi-3。另外,还构建了只含有RNAi抑制表达载体正、反义片段间隔序列查耳酮合成酶基因(CHSA)内含子(intron)的对照载体p35S：intron。3.农杆菌介导的相关植物表达载体对柑橘的遗传转化及转基因植株的鉴定将构建的citLGT基因的相关植物表达载体通过农杆菌介导法分别转化有延迟苦味的锦橙,经GUS染色和PCR检测筛选共获得了40株转基因植株。4.转基因植株中GUS基因的整合分析从获得的不同载体转基因株系中分别选取三株,大量提取叶片基因组DNA,分别对提取的DNA中的GUS基因进行southern印记杂交分析外源基因在转基因植株基因组中的整合情况。结果表明,外源基因已经成功整合到转基因锦橙基因组中。5.转基因植株中citLGT基因的表达分析从得到的转基因植株分别提取总RNA,经反转录为cDNA后以actin基因为内参、野生型锦橙植株为对照进行qPCR反应,分析citLGT基因在不同载体转基因株系中的表达水平。结果表明,在超量表达转基因植株叶片中citLGT的表达水平显著高于对照,而在RNAi转基因植株叶片中citLGT基因的表达被显著抑制。
【作者】马园园；
【导师】陈善春；邹修平；
【作者基本信息】西南大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】柠檬苦素类似物葡萄糖苷转移酶基因citLGT；RNAi；遗传转化；表达分析；转基因；

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