大足黑山羊PHLDA2基因克隆、定位、组织表达、印记状况和甲基化分析

【摘要】山羊的养殖是动物农业支柱产业之一。近年来,随着人们饮食结构的调整,营养价值高、有益于身体健康的食品越来越受到欢迎。羊肉营养价值高使羊肉市场需求量的增加,因此提高山羊繁殖率成为满足山羊需求市场的关键。绵羊、山羊的繁殖率普遍较低限制了山羊大规模的养殖。成活羔羊数是影响繁殖性能因素之一。有关研究报道,胎盘的正常生长和发育起到关键的作用,胎盘是胎体营养供应的源泉,对胎体的正常生长发育至关重要。PHLDA2（pleckstrinhomology-likedomain,familyA,member2,又称为IPL或TSSC3）,编码含有PH（pleckstrinhomology）同源域的小型细胞质蛋白,具有调节细胞信号、包内运输等功能。研究表明,在人和鼠中,PHLDA2基因为母源表达的印记基因,调控胎盘的生长发育和糖原储存。因此,对山羊PHLDA2基因相关研究具有重要意义。本研究采用RACE方法克隆了山羊PHLDA2基因cDNA全长并进行了详细的生物信息学分析,同时构建了该基因在不同组织中表达谱；通过RT-PCR产物直接测序法分析了该基因在F1代胎盘组织的印记状况,采用巢式PCR法克隆了山羊PHLDA2基因启动子序列并利用亚硫酸盐修饰测序法（BSP）和甲基化特异性PCR（MSP）法绘制了该基因启动子区域和第一外显子区域在胎盘和脾脏组织甲基化图谱。通过实验得到如下结果：利用PCR和RACE方法获得了山羊PHLDA2基因全长cDNA序列,为935bp,包含420bp的开放阅读框、62bp的5’端UTR序列和450bp的3’UTR;polyA长度为32bp,终止密码子为TAA；其编码区编码一段140个氨基酸残基的蛋白序列,预测其分子量大小为15638.7Da,等电点为9.18。对推断的PHLDA2基因核苷酸序列和编码氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明：PHLDA2与己报道的牛、猪、人、猕猴、马PHLDA2基因核苷酸相似性分别为91%、90%、89%、90%,、90%；与来源于牛（Bostaurus,NP001069989）、猪（Susscrofa,NP001167528）、人（Homosapiens,NP003302）的PHLDA2蛋白同源性分别达到99%、93%、83%,而且整体上都很保守,说明它们的PHLDA2从共同的祖先蛋白开始分化发生在相对较近的时间里。采用Real-timePCR方法对山羊PHLDA2基因在不同组织间的表达谱构建。荧光定量结果表明PHLDA2基因在心脏、肝脏、胃、肺脏、肾脏、大脑、舌、胎盘、肌肉组织中都能检测到,但在脾脏中不表达。胎盘中mRNA含量（P<0.01）显著高于其它组织,在其它组织中,PHLDA2基因表达量极低较低且组织间差异均不显著（P>0.05）。PHLDA2基因表达方式和功能在物种间具有保守性,有理由认为PHLDA2基因同样具有负调控山羊胎盘的生长和功能的作用。在牛的胎体和胎盘中,PHLDA2基因被证明为母源表达基因。印记分析结果表明山羊胎盘PHLDA2基因为母源表达基因,进一步证明了PHLDA2基因印记在哺乳动物存在保守性。通过将cDNA序列与NCBI中的山羊基因组序列进行BLAST分析,发现PHLDA2基因被定位于山羊29号染色体,也与NAP1L4和SLC22A18相邻,这一结果为山羊该印记区域的分离与功能的进一步研究提供了基础。以大足黑山羊肌肉组织提取的基因组DNA为模板,采用巢式PCR扩增,克隆片段长1842bp,包括20bp的5’UTR区域和1822bp启动子区域序列。发现得到3个核心启动子序列,分别为TAGGCTGTTTTGAAAGTGGGGGCCCTGGAGCAGGTGGGGCCCCACAGATC（起始：-990,结束：-836,得分：0.97）GCCCGGGGGCGTGCCCGGGGCGGGGGGGGCGGAGCGCGCCAGCGCGGCCA（起始：-82,结束：-42,得分：0.86）和GCGCGGCCACTATAAAGGCGGCTCCCACGCCGCCTGAGTGCATCCCTCAC（起始：-40,结束：9,得分：1.0）。综合三种预测结果,-40bp-9bp区域可能存在启动子活性中心。采用甲基化特异性PCR（MSP）方法,对山羊胎盘组织和脾脏组织PHLDA2基因启动子和第一外显子区域CpG岛甲基化分析。甲基化图谱绘制结果表明启动子区域胎盘组织和脾脏组织甲基化水平分别为22.6%和36%,第一外显子区域甲基化水平胎盘组织和脾脏组织甲基化水平分别为].28%和44.2%,综上结果,山羊PHLDA2基因在胎盘组织和脾脏组织中CpG岛甲基化水平分别为10.3%和40.6%。
【作者】苏鲁方；
【导师】蒋曹德；
【作者基本信息】西南大学，动物学，2014，硕士
【关键词】山羊；印记基因；PHLDA2；组织表达谱；基因定位；甲基化；

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