转Cecropin B基因柑橘对溃疡病抗性的研究

【摘要】柑橘溃疡病是由地毯黄单胞杆菌致变种引起的一种世界性的检疫性病害。该病引起落叶、枯枝和落果,溃疡病病斑导致果品质量降低,影响柑橘经济价值。然而,目前并没有有效的根除柑橘溃疡病的最佳方法。常规育种由于育种周期长、遗传上高度杂合等原因,因此并没有取得良好的效果。而化学农药防治能力有限,且还会造成严重的环境污染。因此,转基因技术成为了柑橘抗病育种的一个有效的手段。研究表明来自柞蚕的抗菌肽基因能够显著提高对柑橘溃疡病的抗性。本实验针对转CecropinB抗菌肽共77株转基因锦橙和塔罗科血橙,选择针刺法对离体叶片进行抗性评价。本实验更进一步地研究了在离体叶片上的发病病斑面积,病斑数量,病情指数以及病原菌的繁殖速度。同时通过实时定量PCR和Southernblotting分析了CB基因在转基因植株中的整合和表达情况。通过实时定量PCR也分析了内源PR-1、MKK4、GST、PrxA基因在转基因植株中的表达变化。为进一步的温室和田间抗性评价提供参考。主要研究结果如下：1.柑橘溃疡病病原菌的分离与纯化采用稀释分离法对典型的溃疡病病叶进行病原菌的分离。经过离体叶针刺接种法接种到野生型叶片上,观察并检测病原菌的致病性。利用稀释分离法获得纯化的溃疡病病原菌。2.接种方法的确定分别采用针刺法和喷雾法对野生型锦橙离体叶片进行接种实验。结果显示针刺接种法处理离体叶片,在培养的第4天,80%的叶片出现肉眼可见的病斑；而喷雾法处理的叶片在培养10天仅10%的叶片出现肉眼可见的病斑。因此,采用针刺接种法进行转基因植株的攻毒实验。3.转基因植株的抗性评价在接种4天时,统计溃疡病病斑数量。通过对转基因植株接种实验,比较发病率、病斑面积大小、病情指数和病斑所含病原菌数量,结果显示,在77株转基因植株中,得到17株抗性增强的转基因植株,其发病率均在44.79%-62.50%之间,显著小于非转基因植株(91%)；病斑指数更是远远小于非转基因植株,病情指数均在0.8%-35.5%之间,显著小于对照(73.3%)；而转基因植株中所含病原菌数量也显著少于非转基因植株,仅是非转基因植株含菌量的0.07-0.80倍。这些数据证明了与非转基因株相比,CecropinB基因能够显著提高转基因植株对柑橘溃疡病的抗性。4.转基因植株中外源基因的检测从抗性增强的转基因植株中提取总的RNA,将其反转录成cDNA,以actin作为内参基因、野生型柑橘为空白对照,进行RT-PCR反应。实验结果表明,抗性增强的转基因植株中的CecropB基因表达量明显高于对照组株系。通过Southernblotting方法结果显示抗性增强的转基因株系大多数转基因为单拷贝,XC-PR11.XC-PR21.PR12.PR8.CB12和CB20植株中转CecropinB基因有两个拷贝,只有CB13植株中转基因为三个拷贝,在非转基因植株中没有显示杂交信号。5.转基因植株中PR-1、MKK4、GST和PrxA基因表达分析在溃疡病病原菌诱导0h、2h、6h、24h、48h和72h后,从抗性增强的转基因植株叶片针刺点中提取总的RNA,通过实时定量PCR方法分析与植物抗性有关的PR-1、MKK4、GST和PrxA内源基因在不同时期的表达量。结果显示在转基因植株中GST、PR-1、PrxA和MKK4基因的表达趋势基本相同,但是其表达水平显著高于非转基因植株,暗示了在转基因植株中,植物体内相关的GST、PR-1、PrxA和MKK4抗病基因被激活,进而更加增强转基因植株对溃疡病的抗性。
【作者】刘琦琦；
【导师】陈善春；邹修平；
【作者基本信息】西南大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】转基因柑橘；CecropinB抗菌肽；柑橘溃疡病；抗病性；针刺法；

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