胭脂鱼血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备及应用研究

【摘要】胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)是我国重要的经济鱼类,近年来,随着胭脂鱼人工养殖技术的成熟,养殖规模的不断扩大,鱼类疾病也越来越严重,尤其是在胭脂鱼幼鱼中不断发生爆发性疾病。这不仅给养殖者造成很大的经济损失,而且也制约了胭脂鱼养殖业的发展。对鱼类免疫系统及其免疫应答规律的研究有助于鱼类病害的防治。鱼类是最早拥有特异性免疫的低等脊椎动物,在鱼类特异性体液免疫中,免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)发挥十分重要的作用。因此,对胭脂鱼Ig的研究有利于揭开胭脂鱼免疫系统应答规律,继而为胭脂鱼疾病防治提供理论基础。单克隆抗体由于其具有特异性强、灵敏度高等特点而受到免疫学家们广泛的关注。胭脂鱼Ig单克隆抗体无疑是了解胭脂鱼Ig结构与功能的有力工具,而获得高纯度的Ig是成功制备胭脂负Ig单克隆抗体的前提。因此,本研究首先采用3种方法分离纯化胭脂鱼血清Ig并对其理化性质进行初步鉴定；其次利用纯化胭脂鱼Ig制备了鼠抗胭脂鱼Ig的单克隆抗体并对其特性进行一系列的鉴定；最后通过免疫沉淀、细胞流式术和免疫组化技术探讨制备的抗体是否识别胭脂鱼外周血中Ig和Ig+白细胞。具体研究结果如下：1)分别采用ProteinA亲和层析、MBP亲和层析和Sepharose-4B凝胶层析纯化胭脂鱼血清Ig。纯化产物经SDS-PAGE检测表明：MBP亲和层析和Sepharose-4B凝胶层析均能成功纯化出胭脂鱼血清Ig且其重链和轻链的相对分子量分别约为68.6kDa和28.9kDa;ProteinA亲和层析不适合纯化胭脂鱼血清Ig。纯化产物分别经NanosepCentrifugalDevices柱离心浓缩后并经BCA蛋白定量测定蛋白含量,其结果表明：1mL胭脂鱼血清分别经MBP亲和层析和Sepharose-4B凝胶层析纯化后蛋白浓度分别为0.6mg/mL和0.523mg/nL,体积约为180μL和480μL,质量约为108μg和251.04μg。从结果可以看出,Sepharose-4B凝胶层析纯化产物含量高于MBP亲和层析产物。2)以Sepharose-4B凝胶层析纯化的胭脂鱼血清Ig为抗原免疫Balb/c小鼠,采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选和有限稀释法克隆成功制备了3株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为Y5-B11-C11、Y8-G1-E8和Y9-F12-E9。3株阳性杂交瘤细胞染色体经鉴定表明其染色体的数目均在94-103之间；抗体的亚级份测定结果表明：Y5-B11-C11的重链类型为IgG1,Y8-G1-E8和Y9-F12-E9的重链类型为IgG2b,3株单克隆抗体的轻链类型均为K；间接ELISA检测单克隆抗体的效价和特异性其结果表明：3株单克隆抗体的细胞上清效价为1：1600-1：3200且3株单克隆抗体都能特异识别胭脂鱼Ig,而与草鱼、鲫鱼、鲢鱼、南方鲇、斑点叉尾绷、罗非鱼和鲈鱼血清无任何交叉反应；Western-blotting检测结果表明：Y8-GI-E8和Y9-F12-E9识别变性条件下胭脂鱼Ig轻链且与胭脂鱼Ig的重链、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、南方鲇和罗非鱼血清无任何反应,而Y5-B11-C11与变性条件下的胭脂鱼血清和纯化Ig均呈阴性反应；间接ELISA检测Y8-G1-E8和Y9-F12-E9识别抗原表位的性质结果表明：这2株单克隆抗体识别抗原表位均为构象依赖性表位；利用叠加ELISA分析Y8-G1-E8和Y9-F12-E9识别表位的异同,结果表明：Y8-G1-E8和Y9-F12-E9识别的抗原表位相同或者相近。3)研究单克隆抗体Y8-G1-E8在免疫沉淀、细胞流式术及免疫组化中的应用。免疫沉淀的结果表明：该单克隆抗体能特异识别胭脂鱼血清Ig；外周血白细胞流式术的结果表明：该单克隆抗体的阳性率为41.8%；外周血细胞涂片和外周血白细胞甩片的免疫组化检测结果表明：该单克隆抗体能特异识别胭脂鱼外周血中I旷细胞主要为淋巴细胞和粒细胞。本研究所制备的抗胭脂鱼Ig单克隆抗体可特异性识别血清Ig和外周血中I矿阳性细胞,这为进一步研究胭脂鱼Ig的结构、功能和理化性质以及免疫器官中I矿阳性细胞的发生和定位提供工具,为研究胭脂鱼血清中抗体的产生、持续时间和消亡规律提供资料,也为胭脂鱼疾病的早期诊断技术和疫苗免疫效果的评价方法提供理论基础。
【作者】张庆璜；
【导师】张小萍；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】胭脂鱼；免疫球蛋白；单克隆抗体；

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