棉花GhLFAE相互作用蛋白的筛选与验证

【摘要】棉花是我国重要的经济作物,其产品棉纤维是一种重要的纺织原材料。在棉花的生长过程中,棉纤维的产量和质量直接决定了棉花的生产效益。因此,如何提高棉纤维产质是棉花育种的主要目标。研究表明,细胞膜的通透性对棉纤维发育所需膨压的维持有着重要的影响。多不饱和脂肪酸(PUFA)作为膜脂的重要构成成分,其含量以及成分的变化能直接改变细胞膜的流动性以及通透性。因此,研究棉纤维细胞发育过程中调控PUFA合成相关基因,对阐明纤维细胞发育的分子机理具有重要意义,同时,并为棉花育种提供理论依据,对提高棉花的纤维产量有着重要的理论意义。课题组前期利用酵母双杂交的方法,以GhSCFP作为诱饵筛选到了一个与拟南芥KCS同源的超长链脂肪酸延伸酶GhLFAE(GossypiumhirsutumLongchainFattyAcidElongationenzyme)在烟草中超量表达GhLFAE基因促进多不饱和脂肪酸(PUFA)的生成,并且可以改变细胞膜通透性。但是,GhLFAE基因在棉花纤维细胞发育过程中的作用以及影响细胞膜通透性的分子机制尚不清除。本论文采用酵母双杂交技术,以GhLFAE蛋白作为诱饵,筛选与之相互作用的蛋白；然后利用实时定量PCR分析了与GhLFAE相互作用蛋白编码以及的表达特性,最后用双分子荧光互补实验(BIFC)的方法验证筛选出的靶蛋白与GhLFAE的相互作用。主要结果如下：1.诱饵蛋白的自启动以及毒力检测成功构建诱饵表达载体pGBKT-GhLFAE,并对其进行了自激活以及毒力测试实验。结果显示,诱饵蛋白GhLFAE不能单独启动Y2HGOLD菌株中报告基因的表达,并且对酵母细胞无毒性,可以进行后续酵母双杂交实验。2.酵母双杂交筛选,验证与GhLFAE相互作用的蛋白提取棉花8DPA纤维RNA,并反转录为cDNA转入酵母Y187中构建酵母文库,与构建的含诱饵表达载体pGBKT-GhLFAE的酵母菌株进行杂交,经过多次筛选后获得29个阳性克隆。对这些阳性克隆序列进行BLAST比对,分析发现其分别为：陆地棉蓝铜蛋白GhBCP2(GossypiumhirsutumBlueCopperProtein)、蔗糖转运蛋白SUT2A.葡聚糖β-1.3-葡糖苷酶前体(PR2)基因以及几种未知功能蛋白基因。通过共转化实验以及载体互换共转化实验(Swich)验证。实验证明：在酵母中陆地棉蓝铜蛋白GhBCP2、蔗糖转运蛋白SUT2A、葡聚糖p-1.3-葡糖苷酶前体(PR2)均与GhLFAE存在着相互作用。3.表达分析鉴定相互作用蛋白利用RT-PCR对上述靶蛋白编码基因在陆地棉的不同组织以及不同发育时期的表达水平进行了分析。结果表明：GhPR2在棉花纤维中的表达含量较少、其表达模式与GhLFAE不符、GhSUT在棉花的各组织中均有表达,GhBCP2在棉花6-8DPA的纤维中优势表达,其表达模式与GhLFAE最为接近。所以我们选取GhBCP2进行下一步的验证分析。4.双分子荧光互补技术(BIFC)验证GhBCP2与GhLFAE的相互作用利用BIFC的方法对GhBCP2与GhLFAE在植物细胞中的相互作用作进一步验证。将GhLFAE与GhBCP2分别与荧光蛋白YFP的N端以及C端进行融合,构建双分子荧光载体,并转入农杆菌EHA105中。共同侵染烟草叶片后,利用激光共聚焦显微镜观察发现在叶片细胞,结果发现叶片细胞膜中有强烈的黄色荧光信号,表明GhLFAE与GhBCP2存在相互作用,且定位于烟草叶片的细胞膜中。
【作者】杨舟；
【导师】侯磊；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】棉花；GhLFAE；酵母双杂交；蛋白质互作；双分子荧光；

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