拟南芥AILP1基因功能的初步分析

【摘要】铝诱导蛋白AILPs（aluminuminducedproteins）是植物在铝毒害条件下产生的一类胁迫蛋白,它们可能参与了植物的耐铝过程。我们实验室前期从棉花胚珠/纤维cDNA文库中克隆了一个在胚珠中优势表达的棉花铝诱导蛋白基因GhAILP1,该基因表达水平的变化,将影响棉花胚珠和纤维的发育,也使得胚珠中碳、氮及糖的含量发生变化,从而对种子重量产生影响。与对照株系相比,超量表达GhAILP1转基因株系籽棉和皮棉产量均有提高,反义抑制转基因株系单株籽棉和皮棉产量均下降。推测该基因在棉花高产育种中可能具有重要的应用价值,但该基因的生物化学功能尚不清楚。拟南芥是很好的模式生物,对拟南芥的研究可以为其它物种中同源基因功能的研究提供参考。前人对拟南芥铝诱导蛋白基因AtAILP1已经有了一些研究,但这些研究只是停留在转录水平分析上,没有对其生理功能进行深入研究。为了明确AtAILP1是否也有与GhAILP1类似的功能,并希望通过对AtAILP1的研究为GhAILP1的深入研究提供参考。本论文以拟南芥为材料,对AtAILP1的功能进行了研究。主要实验结果如下：1.AtAILP1基因的表达模式和诱导模式分析为了研究AtAILP1基因的表达模式,用QuantitativeReal-TimeRCR检测了AtAILP1基因在拟南芥不同发育时期不同器官中的表达水平,发现该基因在播种后20d的拟南芥幼苗地上部分表达量高于地下部分；在播种后60d拟南芥的莲座叶、茎、角果中AtAILP1的表达水平较高。AtAILP1启动子驱动的报告基因GUS主要在拟南芥的茎、莲座叶、茎生叶、花萼、花柱、花柄、花丝、角果果柄、果皮及角果内的瓣膜等地上部分的组织器官中表达,在拟南芥根尖部位也有GUS基因表达。这些结果与AtAILP1在不同组织器官中的表达分析结果一致。用50μmol/L的IAA对播种8d的拟南芥（Col-0）幼苗分别处理0h、2h、4h、6h、12h、24h,然后提取幼苗的总RNA,用QuantitativeReal-TimeRCR检测了不同时间处理后拟南芥幼苗中AtAILPl基因的表达水平。结果显示：与未处理相比,生长素处理2h、4h、6h、12h、24h后,拟南芥幼苗中AtAILPl的表达水平分别提高1.26倍、1.37倍、1.96倍、6.31倍、22.92倍,说明AtAILPl基因的表达是受生长素诱导的。同样浓度的生长素处理PAtAILPl::GUS转基因拟南芥幼苗,随着处理时间的延长,GUS染色加深,这一结果从侧面证明了AtAILPl受生长素诱导。而较为特殊的是,生长素处理后,在PATAILPI::GUS转基拟南芥因幼苗的根尖伸长区和根冠中观察到明显蓝色信号,而成熟区和分生区没有蓝色信号。2.AtAILPl蛋白亚细胞定位分析为了分析AtAILPl蛋白的亚细胞定位情况,我们将AtAILPl开放阅读框ORF（去除3’端终止密码子）与绿色荧光蛋白基因GFP融合,构建了p5-35S-AtAILPl::GFP表达载体,利用农杆菌浸花法将35S-AtAILPl::GFP转入拟南芥。用激光共聚焦显微镜对35S-AtAILPl::GFP转基因拟南芥的根尖细胞进行GFP荧光观察,结合植物质壁分离实验发现：细胞膜上有绿色荧光信号。另外,将p5-35S-AtAILPl::GFP转染拟南芥原生质体,结果显示绿色荧光信号出现在细胞膜上。说明AtAILPl蛋白定位于细胞膜。3.AtAILPl表达水平的变化影响了拟南芥的糖代谢过程我们对AtAILPl表达水平下降的拟南芥突变体arf6-1和SALK115757,RNA干扰株系RNAi-B、RNAi-D,超量表达株系35S-6、35S-7和野生型拟南芥（WT）莲座叶中的糖（葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性总糖）含量进行测定,发现超量表达AtAILPl的拟南芥株系莲座叶中蔗糖和果糖含量增加明显。与对照相比,超量表达株系35S-6和35S-7莲座叶中的蔗糖含量分别提高72.5%和87.1%,果糖含量分别增加57.4%和97.3%。葡萄糖和可溶性总糖含量变化不明显。而在AtAILPl表达量下降的拟南芥莲座叶中葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性总糖含量变化趋势不稳定。这些结果说明AtAILPl基因的表达量变化可能会影响拟南芥莲座叶中的蔗糖和果糖的代谢过程。另外,用酶法对WT、arf6-1、SALK115757三个拟南芥株系角果（花发育第17期的角果）中的葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量进行了测定,结果显示：AtAILPl表达量下调的突变体株系中葡萄糖、果糖和淀粉含量升高,而蔗糖含量下降。说明AtAILPl主要影响了角果中蔗糖与其它糖之间的转换。4.超量表达AtAILPl增加了拟南芥的千粒重,下调AtAILPl的表达量则降低了拟南芥的千粒重。为了解AtAILPl对拟南芥种子生长的影响,我们测定了各个拟南芥株系的千粒重,每个株系做三个重复。WT、arf6-1、SALK115757、RNAi-B、RNAi-D、35S-6、35S-7株系的千粒重分别为0.0174g、0.0167g、0.0163g、0.0159g、0.0150g、0.0184g、0.0198g。与野生型拟南芥相比,超量表达AtAILPl的35S-7株系千粒重有明显增加,而RNAi-D株系千粒重下降,其它株系千粒重变化不明显以上结果表明AtAILPl受生长素的诱导,在细胞伸长过程中起作用。该基因表达水平的变化影响了拟南芥的糖代谢过程,进而影响了拟南芥的种子发育。
【作者】张祚；
【导师】李德谋；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】拟南芥；AtAILP1；生长素；糖含量；

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