棉花bHLH蛋白基因的克隆、表达及生物信息学分析

【摘要】BHLH(basichelix-loop-helix)是植物中一类重要的转录因子,它广泛参与光形态建成、光信号转导、次生代谢产物的合成等多种生理过程。类黄酮包括一大类次生代谢产物,其中花色素、原花色素、黄酮、黄酮醇等是植物重要的呈色物质,具有重要的生理功能,同时也是影响农产品营养和外观品质的一个重要因素。植物中花色素和原花色素的合成主要受三类转录因子(MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白)的调控,它们可以相互结合形成转录复合体作用于下游结构基因的启动子,进而激活这些结构基因,促进花色素和原花色素的合成。棉花是世界上最重要的纤维作物。本研究以雷蒙德氏棉的全基因组序列为基础,对棉花bHLH蛋白基因进行生物信息学分析。此外,进一步从陆地棉中克隆出与花色素和原花色素合成相关的bHLH蛋白编码基因,并且对它们进行了表达分析。主要结果如下：1.棉花bHLH蛋白编码基因的鉴定以棉属基因组序列和表达序列为基础,我们共鉴定了294个bHLH蛋白编码基因。这些bHLH蛋白编码基因在雷蒙德氏棉的13条染色体上均有分布,每条染色体上含有13到43个bHLH蛋白编码基因。2.棉花bHLH蛋白的进化分类为了全面分析棉花bHLH蛋白家族的特征及其与其它植物的同源蛋白的关系,我们将棉花的281个bHLH蛋白和拟南芥的172个bHLH蛋白进行了系统进化分析。运用MP和NJ两种分类方法,结果将棉花和拟南芥的bHLH蛋白划分为37个亚家族。相对于拟南芥,棉花bHLH蛋白家族在种类上没有发生改变,只是部分亚家族成员数量的增加。3.第5亚家族组bHLH蛋白编码基因的生物信息学及表达分析在系统进化树分析中,棉花bHLH蛋白GobHLH058、GobHLH060、GobHLH106、GobHLH119和GobHLH126与拟南芥AtbHLH001、AtbHLH002、AtbHLH012和AtbHLH042都位于同一亚家族(第5组)。多重序列比对显示,除了高度保守的HLH结构域外,bHLH蛋白的N端也具有三个高度保守的结构域(BOX11、BOX14和BOX33)。定量RT-PCR分析表明,GobHLH106与GobHLH119在棕色纤维和红色叶片组织中优势表达,分别是原花色素和花色素大量积累的结果。这一结果暗示GobHLH106与GobHLH119可能参与调控棉花花色素和原花色素的合成。4.陆地棉中GhbHLH106与GhbHLH119的克隆、表达及信息学分析我们分别从陆地棉、中棉和雷蒙德氏棉基因组中克隆获得了GobHLH106与GobHLH119的同源基因。结果发现陆地棉中各自存在2个拷贝的GobHLH116和GobHLH119,它们分别来源于A、D基因组,并分别将它们命名GhbHLH106AID(?)GhbHLH119AID。序列比对显示,GhbHLH106和GhbHLH119在陆地棉、中棉和雷蒙德氏棉中是高度保守的。进化分析显示,GhHLH106和口GhbHLH119序列分别与来源于中棉(AA)基因组中的GabHLH106和GabHLH119以及来源于雷蒙德氏棉(DD)基因组中的GrbHLH106和GrbHLH119是同源的。定量RT-PCR分析表明,GhbHLH106A/D和GhbHLH119A/D均能同时在棕色纤维与红色叶片组织中优势表达。这些结果显示,异源四倍体陆地棉保留了来源于二倍体的bHLH蛋白编码基因。5.烟草的瞬时表达为了探究GhbHLHl06和GhbHLHl19在调控花色素合成过程中的功能,我们从陆地棉中克隆了GhbHLH106和GhbHLH119的cDNA序列,并通过烟草的瞬时表达实验分析了它们在激活花色素合成相关的结构基因时的功能。双荧光定量检测结果显示,GhbHLH106-A和GhbHLH119-D都可与棉花R2R3-MYB基因GhPAP1-D2相互作用,激活拟南芥的启动子DFR。这一结果表明GhbHLH106和GhbHLH119蛋白可能通过与GhPAP1-D2蛋白互作,正调控花色素结构基因的表达。
【作者】刘厚生；
【导师】肖月华；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】棉花；bHLH；克隆；信息学；瞬时表达；

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