一个TIGR04312类蛋白Bbrpd1与球孢白僵菌发育分化及侵染致病的关系

【摘要】附着胞形成和穿透昆虫体壁是球孢白僵菌(Beauveriabassiana)等病原真菌侵染致病的关键环节。课题组前期研究发现,Bbmpk1MAPK信号途径是调控球孢白僵菌附着胞形成和穿透昆虫体壁的重要途径,阻断该信号途径导致菌株不能形成附着胞,穿透寄主体壁的能力丧失。附着胞形成时期的抑制削减杂交文库(SSH)筛选结果发现,31个基因在Bbmpk1信号阻断突变体中不表达和显著下调(Zhangeta1.,2010)。研究这些靶标基因与球孢白僵菌侵染致病过程中的作用,对认识Bbmpk1调控病原菌侵染致病的分子机理具有重要意义。A570克隆是一个在野生菌株附着胞形成时期特异表达的基因,该基因编码蛋白与多种真菌的RegulatoryPdomain-containprotein高度同源,命名为Bbrpd1。新近公布的球孢白僵菌ARSEF2860基因组序列将Bbrpd1编码蛋白注释为转录调控子(EJP62179.1)。Bbrpd1启动子序列含有多个氮源调控元件结合位点,推测该基因在侵染过程中与氮源利用相关。王桂江利用基因破坏等方法研究发现,Bbrpd1依赖氮源影响球孢白僵菌分生孢子产生(王桂江,2011)。本论文在此基础上,结合序列分析、表达以及构建超量表达菌株等方法,进一步研究了Bbrpd1与球孢白僵菌发育分化及侵染致病的关系。主要研究结果如下：Bbrpd1序列分析及表达特性。生物信息学分析发现,Bbrpd1推测的编码蛋白在N-末端含有24个氨基酸残基的信号肽序(1-24aa),C-端含有387个氨基酸残基(74-460)的choice-of-anchorBdomain(1.8E-118),属于TIGR04312类分泌蛋白,无明显的亚细胞定位信号和DNA结合元件。由此推测,Bbrpdl可能是一个分泌蛋白,并非转录因子或调控蛋白。Real-timeRT-PCR分析表明,Bbrpd1在分生孢子产生和成熟过程中表达量随着时间的延长而呈下降趋势,而在液体培养过程中随着培养时间的延长或营养消耗的加剧,表达水平呈上升趋势。不同氮源诱导条件下,Bbrpd1表达受硝态氮和亚硝态氮的强烈诱导。由此推测,Bbrpd1可能参与球孢白僵菌分生孢子产生、营养胁迫或氮源利用等生物学过程。破坏和超量表达Bbrpd1影响球孢白僵菌生长发育。在完全培养基PDA和SDAY、基本培养基CZM(以N03-1-N为唯一氮源)上,Bbrpd1基因破坏突变体(△rpdl)菌落生长速率比野生菌株分别降低了8.5%、15.6%和10.3%,而超量表达转化子Bbrpd1(OE-rpdl)菌株在SDAY、PDA的菌落生长速率比野生菌株分别降低了5.3%、8.1%。在NO2-1-N为唯一氮源的培养基中,ArpdI和OE-rpd1的生长速率均低于野生菌株,分别比野生菌株降低了9.4%和6.2%。在以(NH4)2SO4(NH4+-N)、蝉蜕(Cuticle)和蛋白胨(Peptone)为唯一氮源的培养条件下,Arpdl和OE-rpd1的生长均比野生菌株快,其中Arpdl的生长速率分别比野生菌株增加了30.0%、7.0%和11.7%,OE-rpd1的生长速率比野生菌株分别增加了5.9%、4.6%和19.6%。在以Gln为唯一氮源条件下,Arpdl的生长快于野生菌株(8.1%),而OE-rpd1的生长却比野生菌株慢(7.1%)。由此表明,Bbrpdl严格受氮源调节,影响球孢白僵菌营养生长。硝酸还原酶活性测定发现,在以NaNO2(NO2-1-N)为唯一氮源条件下,超量表达Bbrpd1显著提高了酶活性,而破坏Bbrpdl则明显降低了酶活性。由此推测,Bbrpd1影响N021-N的利用可能涉及硝酸还原酶活性的调节。Bbrpd1依赖于氮源影响球孢白僵菌分生孢子产生。在完全培养基SDAY和PDA、基本培养基CZM(以N03-1-N为唯一氮源)以及蛋白胨(peptone)和Gln为唯一氮源的培养上,Arpd1的分生孢子产量分别比野生菌株提高了0.51、1.32、1.19、0.36和3.84倍,OE-rpd1的产孢量却比野生菌株降低了0.5、0.49、0.77、0.88和1.25倍。在以NH4+-N为唯一氮源的培养平板上,Arpdl和OE-rpd1的分生孢子均高于野生菌株,分别提高了3.95和3.0倍。而在N02-1-N为唯一氮源的条件下,Arpd1和OE-rpd1的产孢量均显著低于野生菌株。由此表明,Bbrpd1依赖于氮源影响球孢白僵菌分生孢子产生利用Real-timeRT-PCR分析了5个产孢相关基因F1bA、F1bB、F1bC、F1bD和F1uG在野生菌株、Arpdl和OE-rpdl产孢过程中的转录水平。结果表明,5个产孢相关基因在野生菌株、Arpdl和OE-rpd1产孢过程中的转录模式存在明显差异,且应不同氮源条件而变化。推测破坏和超量表达Bbrpdl影响球孢白僵菌分生孢子产生可能与干扰产孢相关基因的表达有关。破坏和超量表达Bbrpd1影响球孢白僵菌孢子萌发。分生孢子活力测定表明,破坏Bbrpd1(?)口速了孢子萌发,萌发中时(9.4h)比野生型(11.2h)提前了1.8h;而超量表达Bbrpd1则延迟了孢子萌发,萌发中时(12.2h)比野生型(11.2h)滞后了1h。由此表明,Bbrpd1影响球孢白僵菌分生孢子活性。破坏和超量表达Bbrpd1影响球孢白僵菌疏水性和附着性。疏水性检测表明,破坏和超量表达Bbrpdl均增强了分生孢子的疏水性,分别比野生菌株提高了12%和5%。固体表面附着性测定结果发现,△rpd1和OE-rpd1分生孢子在亲水表面的附着性低于野生菌株,由此表明,Bbrpd1是影响菌株孢壁表特性的重要因子。破坏和超量表达Bbrpk1影响球孢白僵菌的毒力。通过“经典”的体壁接种和微量注射分生孢子到昆虫血腔两种方法进行生物测定,破坏Bbrpd1增强了菌株毒力,在相同剂量下半致死时间(LT50)明显缩短。而超量表达Bbrpd1菌株毒力有所下降。表现为半致死时间延长。由此表明，Bbrpd1是影响菌株毒力的重要因子。
【作者】殷欢；
【导师】张永军；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】球孢白僵菌；TIGR04312类蛋白；毒力；生长发育；

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