钙调磷酸酶催化亚基调控球孢白僵菌生长发育、细胞壁结构完整性和毒力

【摘要】钙调磷酸酶是目前所知唯一受Ca2+/钙调素调控的Ser/Thr蛋白磷酸酶,由一个催化亚基CNA和一个调节亚基CNB组成的异源二聚体。催化亚基CNA主要参与真菌的孢子形成及菌丝形态,调节细胞内阳离子平衡,细胞壁的合成及病原真菌致病性。课题组前期从昆虫病原真菌球孢白僵菌中克隆了钙调磷酸酶催化亚基Bbcna,发现Bbcna影响菌落形态、分生孢子产生以及影响白僵菌对杀真菌剂咯菌氰的敏感性。破坏Bbcna导致菌株毒力下降,并且与分生孢子疏水性和附着性下降和附着胞形成率下降密切有关(武增强,2010)。另外,研究发现Bbcna突变体容易失活,推测Bbcna可能参与球孢白僵菌环境适应性调节。有关Bbcna调节菌株生长发育、活力及细胞表面特性的生理生化机制,尚待进一步明确。本论文通过重新构建Bbcna破坏突变体,结合回复互补,进一步探究了Bbcna与菌株活力、发育分化及细胞壁结构及表面特性、毒力的关系及可能机制,并通过比较转录组学分析Bbcna与细胞壁结构完整性(CWI)信号途径Bbslt2的关系。主要研究结果如下：1.破坏Bbcna影响菌株生长发育破坏Bbcna基因影响了球孢白僵菌生长发育,导致分生孢子产生显著降低,孢子活力下降。在完全培养基1/4SDAY与PDA和基本培养基CZM平板上,ABbcna的生长速率分别比野生菌株下降了16.23%、44.12%和28.57%。在1/4SDAY、PDA和CZM平板上,ABbcna的产孢量分别比野生菌株下降了43.68%、51.89%和22.23%。分生孢子萌发率检测结果表明,破坏Bbcna延迟了孢子萌发速率,新鲜分生孢子萌发中时比野生菌株延长了2.5h左右。随着贮存时间的延长,△Bbcna(?)舌力下降迅速。在4℃和26℃贮存40d,野生菌株的孢子活力分别为90.35%和92.08%,而△Bbcna的活孢率分别下降至33.32%和55.37%。分生孢子活性氧(ROS)检测结果发现,△Bbcna孢子随贮存时间的延长,胞内ROS相对于野生菌株的水平则呈上升趋势。由此推测,△Bbcna可能参与胞内活性氧的调节,影响菌株活力。2.Bbcna调节细胞壁结构完整性破坏Bbcna引起菌株对细胞壁合成抑制剂刚果红的敏感性增强。刚果红对ABbcna半抑制浓度为2.819mg/mL,显著低于对野生菌株的半抑制浓度(4.642mg/mL)。透射电镜观察发现,破坏Bbcna影响了细胞壁结构,细胞壁明显变薄。细胞壁成分测定结果表明,破坏Bbcna导致细胞壁总糖含量和p-1.3以及p-1,6葡聚糖含量上升,而几丁质含量却显著下降。由此推测,Bbcna可能通过调节细胞壁组成,影响细胞壁结构和完整性。3.Bbcna影响球孢白僵菌细胞表面特性疏水性测定结果表明,破坏Bbcna降低了分生孢子疏水性,突变体疏水性比野生菌株下降了41.54%。固体表面附着性测定结果发现,ABbcna在疏水表面的附着性显著低于野生菌株,而在亲水表面的附着性却显著高于野生菌株。植物凝集素结合试验发现,ABbcna对ConA(检测葡聚糖)和WGA(检测G1cNAc)结合明显低于野生菌株,而对GNL(检测α-甘露糖)的结合却强于野生菌株。由此表明,破坏Bbcna影响了细胞表面疏水性、附着性和碳源表位。4.破坏Bbcna导致菌株毒力下降通过“经典”的体壁接种和微量注射孢子至虫体内进行生物测定,发现破坏Bbcna菌株毒力显著降低。在相同接种剂量下(孢子浓度),体壁接种和注射接种的突变体对大蜡螟的LTso分别比野生型延长了19.87%和21.3%。由此表明,ABbcna是菌株毒力的一个重要影响因子。5.Bbcna和Bbslt2调控的差异表达基因分析在刚果红胁迫条件下,与野生菌株相比,△Bbcna共有603个基因的转录水平发生显著变化,包括350个上调基因和253个下调基因；而细胞壁完整性信号传导途径相关的调控因子△Bbslt2中共有102个基因转录水平发生显著变化,包括31个上调基因和71个下调基因。与野生菌株相比,在△Bbslt2和△Bbcna中有8个基因共同上调,32个基因共同下调,分别占△Bbslt2中上调和下调基因的25.81%和45.07%。这些共同上调和下调的40个差异基因,涉及细胞壁合成、细胞膜代谢、氧化胁迫相关等生物学过程。由此表明,钙调磷酸酶信号途径(Bbcna)和Bbslt2途径在调控球孢白僵菌细胞壁结构完整性过程中存在明显的交互作用(crosstalking)。
【作者】张世伟；
【导师】张永军；
【作者基本信息】西南大学，微生物基因工程，2014，硕士
【关键词】球孢白僵菌；钙调磷酸酶；细胞壁完整性；毒力；

【参考文献】
[1]李梦妍.基于交替传译记忆机制的笔记训练[D].南京航空航天大学,英语语言文学,2013,硕士.
[2]海鸥.上海私营电影院的社会主义改造（1949-1956）[D].上海大学,电影学,2014,博士.
[3]李冠华.基于Skyline的村镇土地利用辅助规划系统的设计与实现[D].西南交通大学,计算机技术,2014,硕士.
[4]刘韵.京郊农产品品牌建设问题研究[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2013,硕士.
[5]祁文智,王凡,王辉,施钦,逢磊,卞兆勇.Pd-Fe/石墨烯多功能催化阴极降解4-氯酚机制研究[J].环境科学,2015,06:2168-2174.
[6]王涛,孟庆春,殷波,王旭柱,王汝霖,熊建设,谭锐,葛玉玲.单总线多点数据采集系统及数据挖掘技术[J].计算机工程与应用,2002,02:201-203+206.
[7]吴俐蓉.高低水平译者英译汉转换层次差异性实证研究[D].湖南师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[8]曹春杰.宽带无线IP网络中的密钥交换协议[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2004,硕士.
[9]张硕.个案工作介入农村青少年辍学问题的研究[D].沈阳师范大学,社会工作,2014,硕士.
[10]朱欣茹.RhoA相关GTP酶激活蛋白调控皮层神经元树突发育的研究[D].复旦大学,药理学,2012,硕士.
[11]张光洁,耿艳楼,安华良,赵新强,王延吉.Zn(OAc)_2/AC催化固定床上从CO_2与1,2-丙二醇合成碳酸丙烯酯及其反应机理[J].化工学报.
[12]曹源,张玉琢,马连川,孙雅晴,穆建成.基于DSPN的高速磁浮运控系统越区切换模型[J].交通运输工程学报,2014,02:90-96.
[13]王萌.大庆长垣三角洲前缘储层精细表征[D].石家庄经济学院,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[14]王行言.面向二十一世纪与发展计算机文化[J].高等工程教育研究.1993(01)
[15]王新辉.基于Web的法院综合管理系统的设计与实现[D].中南大学,2004.
[16]苗静.转基因山羊乳腺表达重组人促红细胞生成素纯化工艺研究及性质鉴定[D].华东师范大学,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[17]张静静.青少年领悟社会支持、自我概念与心理健康关系的探究[D].曲阜师范大学,应用心理（专业学位）,2013,硕士.
[18]吴昊.炼厂蒸汽网络多目标运行优化方法研究[D].东北大学,系统工程,2010,硕士.
[19]李雪.小胶质细胞活化在孕期感染所致精神分裂症大鼠模型中的研究[D].郑州大学,精神病与精神卫生学,2013,硕士.
[20]孙瑶瑶.PI3K-Akt和JNK信号通路与AfMNPV诱导斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡[D].华中师范大学,农业昆虫与害虫防治,2014,硕士.
[21]李晓斌.运用图像处理技术在线监测真空冻干果蔬含水率[D].山西农业大学,农业机械化工程,2013,博士.
[22]杨洋.L波段介质滤波器的仿真与制备[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[23]HEXiangni.A Cross-cultural Comparative Study of English and Chinese Weather Metaphors[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[24]李娜,马静,孙书利.带多丢包和滞后随机不确定系统的最优线性估计[J].自动化学报,2015,03:611-619.
[25]吴忠明.IFAC举行成立二十五周年纪念日庆祝活动及国际讨论会[J].自动化学报,1983,01:62.
[26]杨文杰,唐振民,胡明昊.BtoB网站用户访问模式挖掘研究[J].计算机工程,2003,02:267-269.
[27]王玉洁.AZ51镁合金的低电压微弧氧化研究[D].北京交通大学,2015.
[28]宋宇辰,孟海东.基于DM的购物篮分析ES知识库构建[J].商场现代化,2005,11:152-153.
[29]姜莲君.中国中小企业海外上市动因、现状和对策研究[D].上海交通大学,工商管理,2013,硕士.
[30]杨修波.Al-Zn-Mg(Cu)合金的热处理、微观结构与性能研究[D].湖南大学,材料科学与工程,2014,博士.
[31]李佳敏.政府采购的现状、问题与对策[D].浙江工商大学,行政管理,2013,硕士.
[32]刘静安,张宝智.国外铝加工技术的发展特点与趋势[J].轻合金加工技术.1993(04)
[33]达福文.兰州市公共交通空间分布特征及其可达性研究[D].西北师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[34]谭小翠.关于双调和映射的相关性质的研究[D].湖南师范大学,基础数学,2013,硕士.
[35]徐小平.面向组件的商务决策分析系统的设计与实现[J].计算机应用与软件,2005,01:140-142.
[36]许将,范康梅,钱俊青.制备色谱分离竹叶黄酮中异荭草苷和荭草苷[J].中草药,2014,15:2184-2188.
[37]刘琼.“美国住房金融市场改革”翻译实践报告[D].河南科技大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[38]郭长荔.对外汉语初级综合课解释性教学语言研究[D].南京师范大学,对外汉语教学,2012,硕士.
[39]周君.石墨烯—超分子纳米复合材料的制备及其应用[D].扬州大学,2014.
[40]杨慧.气流输送式排种系统性能试验研究[D].中国农业机械化科学研究院,农业机械化工程,2014,硕士.
[41]刘海龙,仲黎明,吴冲锋.开放式基金流动性风险的最优控制[J].控制与决策,2003,02:217-220.
[42]封盛.论侵权责任法所保护的民事利益[D].华东政法大学,民商法学,2012,硕士.
[43]李雪丹.基于CFD技术建筑结构风荷载数值模拟研究[D].华南理工大学,2013.
[44]徐莉泉.短程生物脱氮系统污泥基团内部氮素迁移转化微生态特性试验研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2013,硕士.
[45]周蕾.论服务中顾客感知与期望的平衡[D].吉林大学,企业管理,2004,硕士.
[46]张博俊.人民币国际化发展机遇与风险分析[D].首都经济贸易大学,国际商务（专业学位）,2014,硕士.
[47]周成勋.穿青人民族认同问题研究[D].贵州民族大学,民族学,2013,硕士.
[48]丁海云.中国经济增长的最优储蓄率研究[D].首都经济贸易大学,国民经济学,2014,硕士.
[49]袁圆.汉剧对明清传奇剧目的继承与发展研究[D].湖北大学,中国古代文学,2011,硕士.
[50]商尧.张家口市特色农业产业发展研究[D].燕山大学,公共管理,2014,硕士.