循环miRNA作为肝癌及肝移植术后排异分子标记物的研究

【摘要】1993年,Ambros和同事在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)体内发现了第一个microRNA-lin-4。Ambros的研究发现,lin-4这一控制线虫发育时相的基因并不编码蛋白质,而是合成两个小的RNA分子。其中一个长度约22nt,另一个约61nt。较长的小RNA呈茎环结构,被认为是较短者的前体。到2001年,Science杂志首次使用成熟miRNA这个单词描述这些小片段RNA,并率先发现miRNA种类繁多,是由一系列小调节RNA组成的。在不同物种间这些小调节RNA的种类和序列有所差别。随后许多实验室发现了更多miRNA,其家族成员迅速增大。miRNA具有以下四个特征：第一,成熟体为大约22nt长度的独立转录产物；第二,成熟的miRNA来自具有特征性茎环二级结构的前体；第三,成熟miRNA由Dicer酶加工而成；第四,成熟的miRNA以及其具有茎环结构的前体在物种之间具有保守性。单链形式的miRNA主要通过形成沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplexes,RISCs)诱导染色体或基因沉默。miRNA通过调控基因表达,可产生包括控制细胞生长、增殖、凋亡、应激等广泛的生物学作用。miRNA与肿瘤关系密切,可能发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用。虽然对以知miRNA分子的功能和作用机制了解甚少,但随着检测技术的不断完善,通过在不同组织中检测miRNA的表达谱发现,miRNA表达谱具有明显的组织特异性。在不同的疾病状态下其表达谱改变具有自身的特性,尤其是在肿瘤组织中。这些特点使得miRNA成为极具前景的新的肿瘤诊断分子标记物和治疗靶点。然而,肿瘤组织水平的分子标记物由于受标本的限制,仅适合用于术后指导个体化治疗,而无法作为早期诊断的分子。优秀的早期诊断分子标记物应具备以下三个特征：一,具有疾病特异性；二,自身稳定不易降解；三,标本获取方便易于检测。一直以来,RNA都被认为是极其不稳定的分子,容易被环境中的RNA酶迅速降解。最新的研究表明,miRNA可稳定存在于外周血中。并且在外周血中的表达水平与疾病状态密切相关。研究发现,miRNA能抵抗RNA酶的降解,稳定存在于外周血中。因此循环miRNA是一个具有巨大前景的疾病分子标记物。肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是死亡率排在第三位的恶性肿瘤。其恶性程度高,被称为“癌中之王”。肝癌起病极为隐匿,5年生存率只有7%左右,超过60%的肝癌患者在首次就诊时已经进入晚期,从而失去根治性治疗的机会。目前临床上常用的肝癌早期诊断标记物为甲胎蛋白(AlphaFetoprotein,AFP)。然而,AFP诊断肝癌的敏感度和特异度并不理想。在妊娠妇女、急慢性肝炎、生殖细胞肿瘤、先天性胆管闭塞、消化道肿瘤等人群中甲胎蛋白亦可能升高。而大约30-40%的肝癌患者AFP并不升高。因此寻找准确有效的早期诊断方法可能是提高肝癌生存率的关键。而循环miRNA定量研究需要稳定的内参照,目前肝癌循环miRNA的研究尚无公认的内参照可用。这导致相同的疾病不同的实验室研究的结果变异大,各研究结果缺乏兼容性无法互相比较。因此寻找循环miRNA稳定内参照是目前研究的首要任务。肝癌是许多慢性终末期肝病发展的最终结局。大部分肝癌患者均伴有基础肝病,乙肝-肝硬化-肝癌被称为“肝癌三部曲”。手术切除只能切除肿瘤,残留的病肝是患者日后复发的温床。而肝移植能够切除肿瘤和硬化的肝脏,同时消除了肝癌和其赖以生存“土壤”。并且肝移植是终末期肝病唯一的根治性方法。虽然免疫抑制剂发展迅速,目前仍有20-4.0%的病人术后出现急性排异。移植术后的排异成为导致移植肝脏失去功能的重要因素,因此对于肝移植术后排异的有效监测是提高移植肝存活率、延长生存时间的重要手段。根据Anglicheau提出的时间轴模型,在疾病的发展过程中,最早发生分子生物学的改变,然后出现病理形态学改变,而临床症状是疾病晚期的表现。分子标记物较于病理、影像学检查更能早期监测到疾病的发生发展。外周血样本采集方便、可动态连续检测、能反映机体的内环境生理和病理变化。因此,血清／血浆分子标记物是临床首选的检验靶标。本研究拟通过高通量芯片和实时定量荧光RT-PCR,结合动物模型筛选验证肝癌早期诊断、肝移植排异相关的miRNA分子。以期为肝癌外科提供准确有效的外周血miRNA分子标记物。第一部分循环miRNA稳定内参照的筛选及应用背景和目的：参照是基因表达水平定量的基础和前提。参照又分为内参照和外参照,内参照是目前普遍采用的基因定量矫正方法。内参照可以去除外界因素以及患者自身状态导致的检测干扰,从而将真正的表达差异真实地呈现。循环miRNA的研究近年才开展,目前尚无公认的内参照。本研究拟通过高通量芯片及实时定量荧光RT-PCR法从血浆miRNA谱中筛选并验证稳定表达的内参miRNA。研究方法：本研究采用含723种人类miRNA探针的安捷伦公司人miRNA芯片V2(AgilentHumanMiRNAMicroarrayV2)获取肝癌患者和对照人群的血浆miRNA谱。其中健康人33例,慢性乙肝患者22例,乙肝肝硬化患者25例,肝癌患者57例。在对照组中还加入了另外两种肿瘤患者(结肠癌41例,肺癌73例)。芯片信号值分为三组,分别为：0-10；10-100；>100。计算发现所有样本全部miRNA的平均信号为16,在10-100组范围内。因此挑选在各组人群中平均信号值在10-100的miRNA。用变异系数权重法挑选出最稳定的5个miRNA,结合文献报道常用的4个miRNA进入下一步qRT-PCR的验证。验证组包括健康人30例,慢性乙肝31例,肝硬化31例,肝癌31例,结肠癌31例,肺癌30例。通过变异系数、geNorm、NormFinder软件对前期挑选的9个niRNA进行稳定性分析,确定最稳定血浆miRNA。挑选另外5种发病率较高的肿瘤人群(包括食管癌23例；胃癌21例；肾癌24例；前列腺癌20例；乳腺癌21例)检测挑选出的最小变异内参照的表达值和变异系数,进一步评估选定的血浆内参miRNA的表达稳定性。在证实该内参miRNA的稳定性后,应用该稳定内参标准化肝癌循环]miRNA的表达值,进行肝癌相关循环niRNA的定量。并检验肝癌相关循环miRNA诊断早期肝癌和AFP阴性肝癌的准确性。实验结果：芯片结果筛选获得了21个信号值在10-100的血浆miRNA。通过变异系数权重法最终获得了5个候选miRNA(miR-1225-3p,miR-1228,miR-30d,miR-939,miR-940)。结合文献检索选取的4个应用较多的血浆miRNA(miR-16,miR-223,let-7a,RNU6B),一共9个血浆miRNA进入下一轮验证。qRT-PCR在184例验证组血浆中进一步检测后发现变异系数最小的为miR-1228(平均变异系数前5位分别是miR-1228=4.5%；miR1225-3p=5.6%；miR-939=6.6%；miR-13d=7.8%；miR-223=9.3%).NormFinder分析显示miR-1228为最稳定的血浆miRNA(稳定系数前5位分别为：miR-1228=0.720;miR-30d=0.814；miR-939=0.875；miR-1225-3p=0.907;miR-16=0.999)。geNorm分析亦显示miR-1228稳定性最佳(M值前5位为miR-1228=2.631；miR-30d＝2.895；miR-1225-3p=2.986；miR-939=3.045;miR-16=3.094).进一步扩大肿瘤人群发现,miR-1228在另外5种发病率较高的肿瘤患者血浆中(食管癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌)表达分布与前述人群类似,变异系数为5.5%。用miR-1228作为内参后,筛选到肝癌相关循环miRNA,其诊断早期肝癌和AFP阴性肝癌的AUC分别为0.888和0.879。结论：miR-1228在血浆总miRNA谱里的表达水平居中,在健康人、慢性乙肝、乙肝肝硬化和肝癌人群中稳定表达,不因疾病状态改变而发生改变。因此,miR-1228可以作为肝癌人群循环miRNA定量的稳定内参照,并且也是潜在的肿瘤患者循环miRNA定量的内参照。第二部分循环miRNA监测肝移植术后急性排异背景和目的：大部分肝癌患者均伴有基础肝病,肝移植能够切除肿瘤和硬化的肝脏,同时消除了肿瘤和其赖以生存“土壤”。并且肝移植是终末期肝病唯一的根治性方法。然而,移植术后的排异成为导致移植肝脏失去功能的重要因素。本研究拟通过高通量芯片、qRT-PCR和动物模型筛选出急性排异相关的循环miRNA。研究方法：建立大鼠原位肝移植模型(Lewis-BN,BN-BN)。排异组采用Lewis大鼠作为供体,BN大鼠作为受体；非排异组用BN大鼠作为供、受体。首先使用安捷伦大鼠miRNA芯片检测术后第7天排异组(n=4)和非排异组(n=4)血浆循环miRNA及肝脏组织miRNA表达谱。Genespring分析表达差异,挑选P<0.005、倍数改变>2且同时在血浆和肝脏组织均有改变的miRNA。挑选的差异miRNA在另一组大鼠模型中用qRT-PCR验证,并增加免疫抑制治疗组(排异+FK506、排异+延迟FK506),分别在移植术后3、7、10天动态监测血浆miRNA的改变情况,检测血清ALT水平作为对比。构建四氯化碳诱导的急性肝损伤模型,检测排异时相关循环miRNA在该模型中的表达改变。同时用另一种大鼠急性排异模型(ACI-Lewis),以及肝移植后免疫耐受大鼠模型(BN-Lewis)进一步观察循环miRNA与排异的关系。为研究排异相关循环miRNA的来源,我们检测对比排异组和非排异组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和外周血淋巴细胞(Peripheralbloodmononuclearcells,PMBCs)等组织和器官排异相关miRNA的表达差异,在表达差异的器官进一步用miRNA原位杂交法(Insituhybridization,ISH)观察其表达分布。抽提血浆微囊泡检测排异相关miRNA表达水平,探讨排异相关的循环miRNA来源。实验结果：通过芯片检测,我们发现共有133个miRNA在肝移植大鼠的血浆中有表达。Genespring分析表达差异,选取在血浆和肝脏组织均有改变的miRNA,共获得9个差异miRNA。用qRT-PCR在另一组大鼠模型中验证发现,循环miR-122、miR-192和miR-146a在排异发生时显著上调[P<0.005、倍数改变(Foldchang,FC>2),并且其上调过程可以被免疫抑制剂所抑制。在四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠模型中我们也观察到了循环miR-122(FC=22.126,P<0.002)和miR-192(FC=8.833;P<0.001)的升高,而循环miR-146a并无改变(FC=1.181;P=0.594)。检测排异组和非排异组的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和PMBCs中miR-122、miR-192和miR-146a的表达差异,发现除了肝脏其余组织均未出现差异表达。进一步的miRNAISH显示miR-146a在排异大鼠肝脏的汇管区高表达,这一区域伴有大量淋巴细胞浸润,而肝细胞中miR-146a的表达在排异组和非排异组无明显差异。微囊泡中miRNA检测发现,排异组miR-146a显著高于无排异组(P<0.001),而miR-122、miR-192的表达差异无统计学意义。结论：我们首次描绘出肝移植大鼠的循环miRNA谱。通过多模型验证发现排异大鼠具有不同的外周血循环miRNA表达。循环miR-122和miR-192可能只反映肝脏的损伤状态,而miR-146a可能是排异特异性miRNA。升高的循环miR-146a可能来源于排异肝脏中的淋巴细胞,并以微囊泡包裹的形式主动释放入血。联合检测循环miR-122、miR-192和miR-146a可能是早期诊断肝移植后排异的有效方法。
【作者】胡捷；
【导师】周俭；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】循环；miRNA；肝细胞肝癌；甲胎蛋白；早期诊断；预后；肝移植；急性排异；分子标记物；

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