山羊IL-15的克隆、表达分析及猪IL-15对胎盘性状的影响

【摘要】白细胞介素15（Interleukin-15,IL-15）是一种多功能细胞因子,在免疫系统和非免疫系统中具有重要的作用。在免疫系统中,参与免疫应答和免疫调节,包括刺激NK细胞、B细胞和T细胞的产生、激活；在非免疫系统中,可引起肌肉萎缩性刺激和肌肉收缩性反应,因其在骨骼肌中表达尤为丰富,而且在运动的肌肉中表达量有上升的趋势,被认为是一种重要的肌肉内分泌因子,或称为肌因子（myokine）。又因其毒性小,易吸收等特点,亦可作为一种新型的免疫佐剂而备受关注。在生产养殖过程中,高产仔的遗传机制一直是繁殖研究过程当中的热点。胎盘作为胎儿成长的临时器官,对其生长有重要的影响。在通过表型选择来提高产仔数未获得很大进展的情况下,胎盘效率（placentalefficiency,PE）作为产仔数育种的一种重要指标越来越受到重视。本研究首先以山羊为研究对象,根据山羊IL-15基因预测的mRNA序列（XM005691220）设计并合成特异性引物。运用RT-PCR方法对山羊IL-15开放阅读框（ORF）进行克隆,扩增,鉴定及生物信息学分析；获得的成熟肽段与pET-32a（+）连接,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达并运用Westernblot方法验证。再次基础上,运用qPCR检测了心、肝、脾、肺、肾、大脑、垂体、肌肉、膀胱、脂肪、胃、胎盘、小肠和下丘脑等14个组织在初生时期,2月龄的梅山猪、杜洛克猪中表达情况并在山羊组织中进一步验证；进一步以荣昌猪为研究对象,采用现场接产的方法对猪胎盘的相关性状进行直接测定,比较不同胎盘效率组的差异；采用直接测序的方式,通过对不同个体的基因序列比对,筛选IL-15基因部分片段多态性位点；利用最小二乘法进行方差分析不同基因型间的胎盘性状、繁殖性状的差异。本研究为以后研究其生物学功能提供相关数据。1.运用RT-PCR方法扩增山羊IL-15ORF,序列分析显示,山羊IL-15共包含486bp全长编码序列,可编码162个氨基酸,能够形成4-a-螺旋结构,同源性比对分析发现,其核苷酸和氨基酸序列与绵羊（97.55%、94.48%）和牛（95.91%、92.02%）的同源性最高,与鸡的同源性最低（48.59%、27.89%）。2.通过PCR方法获得缺失48个氨基酸长信号肽的成熟肽序列,与原核表达载体pET32a（+）构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,获得29kDa的融合蛋白,并使用Westernblot方法进行鉴定。3.通过qPCR方法,采用2-△△Ct的方法构建IL-15基因的组织表达谱。结果表明,IL-15基因在山羊和猪所检测的组织中均有表达,该基因在不同组织中的相对表达量存在显著性差异（p<0.05）,其中在肌肉、脾和胎盘中IL-15的相对表达量最高,在大脑中的表达量最低。4.荣昌猪平均胎盘效率为5.71±0.84g（n=30）,平均窝重为912.27±138.76g（n=30）,产仔数量为9.00±±1.96头（n=30）；不同个体间的胎盘效率差异极显著（p<0.01）。通过比较荣昌猪高、中、低胎盘效率组产仔数量、初生窝重、平均初生重的差异,表明胎盘效率和产仔数量、初生窝重呈正相关,而且荣昌猪胎盘高效率组产仔数量极显著高于中低胎盘效率组分别高出2.6头和4头（p<0.01）。5.经测序分析得出,荣昌猪IL-15外显子4未发现SNP位点,内含子3存在2个SNP位点,出现AB、AB基因型和BB、BB基因型。对IL-15基因两个位点的多态性与对应母猪的胎盘效率、繁殖性能分别做相关性分析,结果表明IL-15基因的A63003G位点,不同基因型存在显著性差异（p<0.05）,AB基因型比AA基因型的胎盘重,初生窝重和平均重明显增加。而在T63280C位点,不同基因型之间的胎盘性状、繁殖性能差异均不显著（P>0.05）,初步判定这个SNP位点对繁殖性能的影响不大。
【作者】彭学强；
【导师】蒋曹德；
【作者基本信息】西南大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】山羊；猪；IL-15；基因克隆；表达；胎盘性状；组织表达谱；

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