丝状支原体山羊亚种乳酸脱氢酶的克隆表达及其免疫学特性的研究

【摘要】由丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma.Mycoidessubsp.capri.Mmc)引起的山羊传染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleuropneumonia,CCPP)是山羊特有的一种接触性传染病。丝状支原体山羊亚种属于丝状支原体簇,丝状支原体簇共有六个成员,PG3标准株是在1951年由Chu和Berieidege两人分离得到。山羊传染性胸膜肺炎的主要临床症状有纤维素性肺炎、高热和胸膜炎等。在我国很多地区发病率较高,给很多地区的山羊饲养业造成了较大的经济损失和潜在威胁。乳酸脱氢酶(LDH)又称为NAD+氧化酶,是生物体内氧化还原反应过程中重要的催化剂之一,也是糖代谢酵解途径的关键酶之一。LDH广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内,在高等动物体内只存在一种乳酸脱氢酶L-乳酸脱氢酶,在细菌中两种乳酸脱氢酶都存在。关于丝状支原体山羊亚种乳酸脱氢酶的研究尚未见报道。本实验对丝状支原体山羊亚种乳酸脱氢酶进行克隆表达,空间结构预测,并对其免疫学特性进行了初步研究,为寻找该病原的靶位点以及进一步研制亚单位疫苗或诊断抗原等后续研究提供理论基础。1.LDH蛋白的克隆、表达及纯化丝状支原体山羊亚种乳酸脱氢酶在大肠杆菌表达的过程中存在3个终止子,因此首先将终止密码子运用重叠引物延伸PCR进行了3个定点突变,进行第一个点突变的第一轮PCR扩增得到长约570bp和408bp的两个基因片段,进行第二三个点突变的第一轮PCR扩增得到长约870bp和114bp的基因片段,进行第二三个点突变的第二轮PCR扩增得到长约957bp的基因片段,与预计片段大小相符,测序结果显示重组表达载体的LDH核苷酸序列三个点突变全部突变成功。将LDH基因连接到pGEX-6P-2原核表达载体上,经酶切及序列鉴定成功构建重组质粒pGEX-6P-2-LDH.重组质粒转化入E.coliXL-1中,0.2mM的IPTG诱导后用谷胱甘肽4B进行纯化,SDS-PAGE鉴定表明已成功表达了61kD的GST-LDH融合蛋白,用PP酶对GST标签进行切除,经过SDS-PAGE鉴定分析,酶切后的蛋白大小为35kD,成功得到了纯化的目的蛋白,为下一步研究该蛋白免疫原性奠定基础。2.LDH蛋白兔抗血清的制备及Western-blotting检测克隆表达并纯化LDH蛋白,与弗氏完全佐剂1：1乳化,通过皮下注射途径免疫2月龄新西兰白兔,第三次免疫一周后收集血清,成功得到抗LDH蛋白的阳性血清,抗LDH血清与纯化的LDH蛋白进行免疫印迹反应,在35kD处出现一条特异性的条带,Western-blotting检测表明,LDH蛋白能与抗LDH阳性血清发生特异性反应,LDH具有良好的免疫原性。3.生物信息学分析生物信息学分析表明,LDH基因编码318个氨基酸,理论相对分子量(Mr)为82851.1;理论分子式为C3114H5273N957O1322S174,原子总数为10840；总亲水性为0.698,蛋白质总体疏水性较高,等电点为5.01。通过对信号肽和跨膜区分析：预测LDH蛋白为非分泌型蛋白,无信号肽；LDH在序列N端第5～25位可能存在跨膜区,编码产物大部分位于细胞膜的外侧。分析蛋白质的拓扑结构、二级结构表明：包含8个螺旋,13个折叠,20个无规则卷曲。预测三级结构表明：LDH为四聚体。根据所获得的丝状支原体山羊亚种LDH的生物信息,通过实验进一步分析、验证其生物学活性,为丝状支原体山羊亚种在病原诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供线索。
【作者】朱淑萍；
【导师】王豪举；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】丝状支原体山羊亚种；LDH；定点突变；免疫学特性；

【参考文献】
[1]席振华.USB反硝化颗粒污泥的培养、运行特性及形成机理研究[D].河北科技大学,环境工程,2014,硕士.
[2]李雨聪.油罐车运输过程视频监控技术研究[D].河南科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[3]戚艳红.新型磁流变阻尼器结构设计与性能分析[D].北京交通大学,2013.
[4]林晓佳.广西山歌的前世今生与未来[D].中国音乐学院,音乐学,2012,硕士.
[5]李文超.超声波检测钢轨伤损及定位研究[D].中北大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[6]谢芹.用于BNCT的IHNI反应堆中子学参数研究及细胞剂量精细计算[D].兰州大学,核能与核技术工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]李在林.基于搜索引擎的航空公司营销效果评估[D].中国民用航空飞行学院,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[8]孙圣钧.企业知识创新功效的提升对策研究[D].沈阳师范大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[9]赵卫平.合同法第68条研究[D].华东政法学院,民商法,2002,硕士.
[10]严慧.TiO_2基和CeO_2基催化剂活性的第一性原理研究[D].大连理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[11]康锐.高新技术服务业发展研究[D].华中科技大学,企业管理,2012,硕士.
[12]周章琳.淘宝商城新规的竞争法分析[D].西南政法大学,经济法（专业学位）,2012,硕士.
[13]李广文.面向夹具CAD的知识挖掘技术的研究与应用[D].南京航空航天大学,2004.
[14]刘子会.干旱胁迫下玉米ABA和pH与钙信使的关系研究[D].河北师范大学,植物学,2004,硕士.
[15]韩娜.可变耦合宽带数控跳频滤波器设计[D].河北大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[16]赵强.纳米材料修饰的离子选择性电极及新型汞膜电极阳极溶出伏安法的研究[D].西南大学,2013.
[17]姜峰.江苏省农业面源污染时空特征及削减方案研究[D].南京农业大学,环境工程,2012,硕士.
[18]曾维周.基于Geoportal的西藏生态安全数据聚合服务[D].成都理工大学,地质工程,2013,硕士.
[19]钟睿.县域旅游经济发展动因与模式研究[D].北京交通大学,2010.
[20]李宗学,贾翠玲,王利利,范文学.基于多传感器融合的吸尘机器人硬件设计[J].内蒙古工业大学学报(自然科学版),2013,02:120-124.
[21]张超.中国共产党管理邯郸城市工商业的初步尝试（1945-1949）[D].河北师范大学,中国近现代史基本问题研究,2013,硕士.
[22]刘启和,李凡,闵帆,叶茂,杨国纬.一种基于新的条件信息熵的高效知识约简算法[J].控制与决策,2005,08:878-882.
[23]武志远.高脂饮食性肥胖对大鼠心功能的影响及氯沙坦的保护作用[D].山西医科大学,儿科医学,2003,硕士.
[24]杨建辉.试论行政强制执行权[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[25]王鹏.发电市场合约管理与机组组合问题研究[D].华北电力（北京）大学,2001.
[26]张建.采用修正来流条件和粗糙壁面处理方法的绕流问题研究[D].北京交通大学,2011.
[27]葛成荫.油页岩热解行为及产物生成动力学研究[D].天津大学,化学工程,2013,硕士.
[28]刘海洋.三维地形生成的关键技术研究[D].哈尔滨工程大学,机械制造及其自动化,2012,硕士.
[29]衣斌斌.新型船用机舱监测报警系统研究与设计[D].大连海事大学,船舶与海洋工程,2014,硕士.
[30]黄保民.全系列空气过滤器性能检测系统[D].天津大学,供热、供燃气、通风与空调工程,2004,硕士.
[31]魏玥.TLR2、TLR4在单肺通气麻醉中的表达[D].广西医科大学,麻醉学（专业学位）,2013,硕士.
[32]宋学义.液压泵站的设计要点(下)[J].液压与气动.1993(06)
[33]王姣.论我国垃圾短信的法律规制[D].西北大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[34]于淼.基于网络经济的第三方支付企业的竞争优势分析[D].北京交通大学,2013.
[35]杨春城.基于像素复用技术的硅基OLED微显示像素驱动电路研究[D].吉林大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[36]李宜生,傅世善.无碴轨道对信号轨道电路的影响[J].中国铁路.2005(03)
[37]陈军,张虎权,王锦喜,王宏斌,陈方方,孟祥霞.AVO技术在碳酸盐岩缝洞型储层预测中的应用[J].石油地球物理勘探,2014,06:1191-1198+6-7.
[38]亓星.滑坡碎屑堆积体形成泥石流的实验研究[D].成都理工大学,地质工程,2013,硕士.
[39]吴一书,陈俊,赵美蓉,王鸿.活性追踪法分离海洋小红酵母中一个活性环二肽[J].中国海洋药物,2013,03:28-32.
[40]柴琳果.基于车路协同系统的交通仿真方法研究[D].北京交通大学,2012.
[41]王旭.发动机电喷单元喷油性能检测技术及方法的研究[D].天津大学,动力机械及工程,2004,硕士.
[42]赵二刚.企业年金市场与寿险公司营销策略研究[D].对外经济贸易大学,工商管理,2004,硕士.
[43]孙义梅,杨春峰,陈程,贾曙光,田世澄.相干技术的参数选取及其效果分析[J].石油地球物理勘探,2001,05:640-645+654.
[44]西乌兰.邓小平民生观研究[D].吉林大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2014,硕士.
[45]蔡燕.新型离子液体电化学性能及在生物传感器中的应用研究[D].江南大学,2011.
[46]王艺源.布尔可满足关键问题研究[D].吉林大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[47]武庆弟.公路施工企业信用体系建设与管理研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[48]黄彬.从三星堆到大足石刻—谈文化价值体系与雕塑本体的关系[D].西南大学,美术学,2014,硕士.
[49]刘洪起.含体积型缺陷的高温蠕变损伤管道的极限载荷分析[D].华东理工大学,化工过程机械,2014,硕士.
[50]陆英华.卵巢过度刺激综合症相关因素探讨[D].苏州大学,妇产科学,2003,硕士.