环磷酸腺苷受体等蛋白的构象变化机理研究

【摘要】很多蛋白通过构象变化而工作,本论文选择环磷酸腺苷受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP)和丙酮酸激酶(Pyruvtekinase,PK)作为研究对象,应用多种技术手段研究其构象变化机理。环磷酸腺苷受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP),也称为分解代谢基因活化蛋白(catabolitegeneactivatorprotein,CAP),是原核生物中一个典型的转录调控蛋白。CRP是由两个相同亚基组成的二聚体,每个亚基中包含两个不同的结构域：较大的N-端结构域主要负责结合环磷酸腺苷(cAMP)分子,而较小的C-端结构域主要负责识别特异的DNA序列。CRP与cAMP结合后,其构象发生变化并与特定序列的DNA结合,该DNA与RNA聚合酶结合后启动转录过程。CRP已经成为构象变化研究中的一个模型蛋白。目前,apo-CRP、CRP-cAMP复合物、CRP-cAMP-DNA复合物、CRP-cAMP-DNA-RNAP复合物晶体结构均已获得。在apo-CRP中,识别DNA的F-螺旋被包埋在内部；当CRP与cAMP结合后,F-螺旋伸展,进而识别特定序列的DNA。尽管人们对该蛋白进行了大量的研究,对其工作机理也有了较深入的认识,但仍有诸多问题等待解决,如apo-CRP、CRP-cAMP2、CRP-cAMP3和CRP-cAMP4的结构已知,但CRP-cAMP,的结构仍未知,而apo-CRP和CRP-cAMP2构象之间发生了很大的构象变化,这使CRP-cAMP相关的结构研究变得尤为重要。丙酮酸激酶(PyruvateKinase,PK)是糖酵解中的一个关键酶,在活化离子存在的条件下,PK催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转变为丙酮酸(pyruvate)。PK是由四个相同的亚基组成的同源四聚体,这四个亚基之间形成了两个近似相互垂直的界面：Y-界面和z-界面。每个亚基包含四个不同的结构域：N-端结构域、结构域A、B、C。每个亚基还包含三个色氨酸：Trp-157、Trp-481和Trp-514,其中Trp-157位于活性口袋中,与Z-界砥接近；而Trp-481和Trp-514位于C结构域中,靠近Y-界面。因此,这些色氨酸可以作为良好的荧光探针来研究丙酮酸激酶在活化离子、底物和抑制剂等不同配体诱导下的构象变化机理。PK的B结构域具有很强的动态性,通过B结构域的旋转可以使得B结构域和A结构域之间的活性口袋分别处于“张开”和“关闭”的构象,“张开”的构象代表PK处于活性状态,而“关闭”的构象则代表PK处于非活性状态。虽然基于这两个状态的模型可以很好的描述丙酮酸激酶的变构调控行为,然而,PK具体的催化变构机理仍不明确。针对以上环磷酸腺苷受体等蛋白在构象变化机理研究方面的问题,本学位论文分为五个章节开展研究工作。各章节主要内容如下：第一章是绪论。首先对环磷酸腺苷受体蛋白和丙酮酸激酶的研究概况和发展前景进行了简述,并在此基础上引出了本文的研究方向,即采用结晶学、光谱学、生物物理等技术手段来研究这两种重要功能蛋白的构象变化机理。第二章主要介绍CRP蛋白cAMP结合结构域的表达、纯化、结晶和晶体结构解析。本论文选择两种特别的蛋白水解酶(枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶)对CRP进行酶切,得到两种CRP的cAMP结合结构域：S-CRP(氨基酸残基1-133)和CH-CRP(氨基酸残基1-137)。本文采用了特殊的结晶方法得到了S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP复合体的单晶,并对其晶体结构进行了解析,其分辨率分别为2.0A和2.8A。本文着重介绍了S-CRP-cAMP复合物的晶体结构：每个不对称的晶胞中包含四个二聚体,它们整体的折叠情况和二聚化方式与全长的CRP分子相似,根据它们结合cAMP的数量和位置的不同,这四个二聚体可以分为三种类型：S-CRP-cAMP2、S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2,。其中,S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2都是第一次获得,研究表明一个cAMP分子也可以使得C-helices(残基112-133)得到重排和稳定化。第三章主要介绍CRP蛋白cAMP结合结构域的构象变化和动态性研究。本论文采用了傅里叶变换红外光谱(FT-IR)技术来研究S-CRP和CH-CRP在结合cAMP前后的二级结构组成以及动态性变化。从而明确CRP铰链区(残基134-138)以及loop3(残基53-57)和Phe136的相互作用在cAMP诱导的CRP构象变化和信号传导中的作用。研究表明,cAMP诱导的CRP活化包含显著的二级结构变化：C-helix含量的增加和βstrand4或者βstrand5含量的减小,即结合cAMP增加了CRP蛋白cAMP结合结构域的稳定性。同时,结合cAMP所引起的C-helix的增加使得S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP的动态性都有所减小。铰链区的存在使得CH-CRP比S-CRP更具动态性,但是,loop3和CRP铰链区的相互作用没有参与构象变化过程中的信号传导。第四章最主要介绍了不同配体诱导下的丙酮酸激酶构象变化机理的研究。本论文分别对PK的三个色氨酸残基进行了定点突变,并通过荧光淬灭、圆二光谱(CD)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等技术分别对野生态和突变体PK进行了研究。定点突变没有改变PK的二级结构,同时,由活化离子和底物诱导产生的荧光信号的变化主要来源于Trp-157,Phe的结合使得Trp-481和Trp-514处于一个更加亲水环境中。本章重点讨论了B结构域的运动在PK催化反应中的作用,即活化离子所诱导结构域B的旋转使得PK活性口袋“张开”,而底物的结合所引起的结构域B的旋转又使得PK活性口袋“闭合”,从而使得PK的催化反应得以进行。第五章主要介绍丙酮酸激酶催化变构机理的热动力学研究。本论文使用等温量热滴定(TTC)技术,首次得到了PK催化底物反应过程中的热动力学常数,明确了不同活化离子(钾离子和镁离子)和抑制剂(苯丙氨酸)在PK构象变化中的作用。活化离子浓度的增加使得反应体系中的活性状态的百分比含量逐渐增加,而增加抑制剂的浓度则会起到相反的作用。另外,我们提出了钾离子和镁离子诱导PK构象变化的机理,即：首先,镁离子的结合使得PK的活性口袋张开,这一过程非常迅速并且只需要少量的镁离子便可以使得PK从非活性状态转变成这种过渡状态。第二,钾离子随后结合到PK上,定位PK的活性部位,这一过程完成了PK从过渡状态到活性状态的转变。
【作者】李丰；
【导师】余绍宁；
【作者基本信息】复旦大学，分析化学，2013，博士
【关键词】环磷酸腺苷受体蛋白；丙酮酸激酶；构象变化机理；结晶；傅里叶变换红外光谱；热动力学；

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