微环境中肿瘤相关成纤维细胞介导的清热化湿中药抗胰腺癌作用研究

【摘要】目的探讨清热化湿中药(清胰化积方,QYHJ)抗胰腺癌过程中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的作用。方法第一部分1.建立胰腺癌皮下移植瘤模型,分成QYHJ组和生理盐水对照组,评价QYHJ对胰腺癌生长的影响。2.建立胰腺癌原位移植瘤模型,分成QYHJ组和生理盐水对照组,评价QYHJ对胰腺癌肝转移的影响。第二部分1.家兔胃饲QYHJ获取含中药血清,并取正常家兔血清为对照组。56℃水浴锅,30分钟,制备灭活的中药血清及正常血清。2.CCK-8法测定正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外增殖的影响,并绘制细胞增殖曲线。3.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外迁移及侵袭能力的影响。第三部分1.采用原代培养的方法建立两对人胰腺正常成纤维细胞(NFs)及对应的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。2.采用免疫荧光(ICC)及Western-blot对原代培养成的成纤维细胞进行鉴定。3.采用RT-PCR、Western-blot技术检测NFs、CAFs及经含药血清处理的CAFs之间CXCL1、2、8表达的差异。4.CCK-8法测定含中药血清对CAFs体外增殖的影响。5.采用免疫组化技术评价QYHJ干预后CAFs在小鼠移植瘤中增殖能力的变化。6.采用免疫组化及Elisa技术评价CAFs表达、分泌CXCL1、2、8能力的改变。第四部分1.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测CXCL1、2、8对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。2.体外成球实验检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌细胞干性的影响。3.流式细胞技术检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌干细胞比例的影响。4.免疫组化法检测人体组织中CXCR1与干细胞标记物CD24/44/133的表达水平。5.统计分析CXCR1及CD24/44/133之间表达水平的相关性。6.统计临床资料分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者临床特征之间的相关性。7.单因素及多因素分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者预后的关系。第五部分体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测NFs、CAFs及经含中药血清处理的CAFs上清对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。结果第一部分在皮下移植瘤实验中,QYHJ组和Control组的成瘤率均达到100%。但Control组与QYHJ组之间肿瘤生长速度存在差异,中药组经过QYHJ干预后肿瘤的生长速度低于Control组,从QYHJ干预第15天开始两组之间肿瘤的生长速度就出现了明显差异(P<0.05)。第21天处死裸鼠,发现QYHJ组平均瘤重小于Control组,Control组和QYHJ组的瘤重分别为0.705±0.198809g、0.435429±0.151751g,抑瘤率为38.24%(P<0.05)。在原位移植瘤实验中,QYHJ组原位移植瘤的体积明显小于对照组,并且QYHJ组小鼠肝脏转移灶的数目(P=0.042)及转移率(P=0.002)也明显少于对照组。提示QYHJ可以有效地抑制胰腺癌的增殖及转移。第二部分四组血清对人胰腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭的抑制能力有显著差异,从高到低分别为中药组、正常、中药灭活组、正常灭活组。正常组高于正常灭活组,这可能和机体在正常情况下的免疫反应有关。中药灭活组高于正常灭活组,这可能和中药有效成分本身对于胰腺癌细胞的直接作用有关。中药组高于中药灭活组,提示中药抗胰腺癌存在间接作用,且这部分间接作用能够有效地抑制胰腺癌的恶性潜能。第三部分经过原代培养建立起两对(#1,#2)相应的NFs和CAFs细胞,并选取上皮细胞标记物人广谱细胞角蛋白(PanCytokeration[AE1/AE3],CK)、E-cadherin,间质标记物Vimentin及CAFs特异性标记物α-SMA,通过免疫荧光(ICC)和Western-blot的方法对其进行鉴定。结果显示NFs和CAFs都不表达上皮细胞标记物CK及E-cadherin,但都表达间质标记物Vimentin,CAFs还高表达其特异指标α-SMA。提示我们成功建立起人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。我们进一步检测了成纤维细胞分泌的CXCL家族的几个因子的表达。结果显示CXCL1、2、8在CAFs中的表达明显高于NFs,且在用QYHJ干预后CAFs中的CXCL1、2、8表达明显下调。体内免疫组化的结果也提示QYHJ组中CXCL1、2、8的阳性率明显降低,进一步检测小鼠血清中CXCLs的含量,发现它们在Control和QYHJ组中含量分别为57.49±5.07pg/LVS43.27±7.01pg/L(P<0.05);42.88±4.00pg/LVS33.92±1.42pg/L(P<0.05);343.03±50.68pg/LVS190.52±39.36pg/L(P<0.05)。同时我们也观察了QYHJ对CAFs增殖的影响,体外增殖实验中QYHJ组OD值明显低于Control组,体内的免疫组化结果提示QYHJ干预后Vimentin和a-SMA表达明显下降,提示QYHJ能抑制CAFs的增殖。第四部分在迁移和侵袭实验当中CXCL1、2、8干预组中Capanl细胞的穿过数量都高于对照组和抑制剂组(P<0.05)。成球实验中CXCL8组中干细胞球的数量明显多于对照组(P=0.000),在加入抑制剂后CXCL8诱导的干细胞成球能力受到抑制(P=0.002)。在CXCL8诱导后Capanl干细胞比例明显高于对照组(P=0.002)和抑制剂组(P=0.03)。临床资料的分析结果显示CXCR1和胰腺癌干细胞标记物CD44/133表达呈正相关,并且和胰腺癌淋巴结转移关系密切。同时CXCR1、CD44/133也和胰腺癌患者的预后相关,CXCR1是胰腺癌患者预后的一个独立相关因素。第五部分NFs组及QYHJ干预后的CAFs条件培养基组比CAFs条件培养基组Capanl细胞穿透数量更少(P<0.05)。结论QYHJ可以有效地抑制胰腺癌细胞的增殖及远处转移,它的这种作用除了本身有效成分之外,还存在间接作用,其中的一个间接靶点在于CAFs。QYHJ可以通过抑制CAFs的增殖以及抑制CAFs分泌CXCL1、2、8间接地达到抗胰腺癌的作用。这种作用主要包括两个方面,胰腺癌细胞的迁移、侵袭以及胰腺癌细胞的干性。
【作者】陈联誉；
【导师】刘鲁明；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合临床，2013，博士
【关键词】清胰化积方(QYHJ)；胰腺癌；肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)；

【参考文献】
[1]侯君伟.我国模板工程技术的新进展——新版《建筑施工手册》第17章内容精选[J].建筑技术.1997(04)
[2]张冬梅.石墨烯热致发声器件的新进展[J].科学通报,2015,18:1748.
[3]姚怡.可上楼梯的智能机器人设计与实现[D].北京邮电大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[4]戚俊达.基于支持向量回归机的无标定视觉伺服研究[D].上海大学,模式识别与智能系统,2014,硕士.
[5]魏鹏飞.针对芝麻压榨特性的双螺杆压榨结构研究[D].中国农业机械化科学研究院,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[6]张琦.紫杉醇或γ线放射介导的自噬现象对Folliculin基因缺陷肾癌细胞放化疗敏感性影响的研究[D].山东大学,外科学,2014,博士.
[7]叶彩玲.小麦白粉病气象环境成因及长期预测研究[D].中国农业大学,气象学,2004,硕士.
[8]曹宇,郭丽,信心,杜高辉.铁硫化物/石墨烯纳米复合材料溶剂热法一步合成[J].浙江师范大学学报(自然科学版),2012,03:311-315.
[9]秦宜.城市高架道路沿线大型商业综合体临街空间研究[D].西南交通大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[10]顾强.老龄化背景下青州市农村养老保障问题研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[11]张泽铭.氧化石墨烯(GO)修饰的TiO_2纳米管阵列光阳极的制备及其在染料敏化太阳能电池(DSSC)中的应用[J].广东化工,2014,14:10-11+17.
[12]王思平.污垢对凝汽器及汽轮机组性能影响的数值分析[D].上海电力学院,热能工程,2013,硕士.
[13]段松,张露露,杨学林,彭刚,黄云辉,覃磊,李明,倪世兵.双相碳改性硅酸铁锂正极材料研究[J].无机化学学报,2014,02:345-352.
[14]方琳.泰国汉语教学中“语文并进”和“语文分开”教学模式实验报告[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[15]刘蓉蓉.DNA序列模体识别问题的迭代算法[D].大连理工大学,计算数学,2013,硕士.
[16]杜文明.《六十种曲》中的侠义形象研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[17]刘建杰.吉林移动增值业务发展战略[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[18]邵习东.碾子山区风电开发规划研究[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[19]雍熙.平阳霉素治疗血管瘤临床研究—单中心21年治疗回顾性分析[D].川北医学院,外科学,2014,硕士.
[20]景文宝,刘玉辉,安鲁彪.甲状腺淋巴瘤误诊为桥本甲状腺炎一例[J].临床误诊误治,2014,12:47-48.
[21]上官文坤.《三国志通俗演义》俊杰论[D].温州大学,中国古代文学,2012,硕士.
[22]李莉敏.Agent技术实现应用流程再造的研究[D].华北电力大学（北京）,计算机应用技术,2003,硕士.
[23]姜彦.服装企业人力资源管理概述[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[24]肖月桂.任务引领型课程教学对中职生学习动机与学业成绩的影响[D].华中师范大学,心理健康教育,2013,硕士.
[25]白士杰.耐浓硝酸不锈钢管的研制[J].四川冶金.1990(04)
[26]赵峰.池塘大型底栖动物群落结构及其部分生态功能的研究[D].华中农业大学,水产养殖,2014,硕士.
[27]肖飞.用于强化学习的值函数逼近方法研究[D].苏州大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[28]吴仁荣.某潜艇用新型海水冷却泵的研制[J].舰船科学技术.1991(02)
[29]李延建.基于自适应控制的列车自动运行仿真研究[D].北京交通大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[30]张鸿.基于WEB的网络综合管理系统的研究与实现[D].武汉理工大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[31]杨勇志.天津市区配电网自动化系统的设计与应用[D].天津大学,电气工程,2013,硕士.
[32]尹娜.基于消费者角度的品牌资产评估[D].长安大学,资产评估（专业学位）,2014,硕士.
[33]董路珏.丹参注射液对激素诱导的OB-OC共育体系中成骨细胞凋亡的影响[D].广州中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[34]李明.Pd/C@Fe_3O_4磁性催化剂的制备及反应性能[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[35]李靖,孙明轩,张晓艳,崔晓莉.染料敏化太阳能电池对电极[J].物理化学学报,2011,10:2255-2268.
[36]靳艳.米渣酱油酿造工艺及品质研究[D].湖北工业大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[37]戴艳丽.神经外科住院患者神经眼科临床特征前瞻性研究[D].中国人民解放军医学院,眼科学,2013,硕士.
[38]梁爱玲（LEONGOiLeng）.澳门地区翻译教学研究[D].北京外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[39]惠志伟.关于Smarandache函数及其下界估计的相关问题[D].西北大学,应用数学,2013,硕士.
[40]邹逸江.空间数据仓库研究综述[J].测绘学院学报,2002,04:287-289.
[41]高海.论我国商业银行信贷风险的管理[D].中国海洋大学,金融学,2003,硕士.
[42]张启明,周自强,谷山强,冯万兴,王海涛.海量雷电监测数据云计算应用技术[J].电力系统自动化,2012,24:58-63.
[43]史中浩.华北油田电网改造项目经济评价研究[D].天津大学,工业工程,2004,硕士.
[44]田笑.汉语形容词重叠式的对泰汉语教学研究[D].湖南师范大学,对外汉语,2014,硕士.
[45]王晓琳.新入园小班幼儿入园分离焦虑常用缓解策略的现状调查研究[D].内蒙古师范大学,学前教育（专业学位）,2013,硕士.
[46]康英.哈尔滨铁路局DC600V地面电源工程成本控制研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[47]高璇.我国民营企业以人为本的绩效管理模式研究[D].内蒙古财经大学,企业管理,2012,硕士.
[48]禹海波.需求不确定性对条件风险价值约束库存系统的影响[J].控制与决策,2013,09:1389-1392+1398.
[49]何爱玲.泰安市健康体检人群脂肪肝病与其他检测指标的关系[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2013,硕士.
[50]毕晓漫.有机光导小分子材料的合成与表征[D].郑州大学,材料学,2013,硕士.