索拉非尼联合放射抗肝细胞癌效应的实验研究

【摘要】第一部分索拉非尼联合放射抗肝细胞癌的体外研究目的：索拉非尼的多激酶抑制作用提示其与放射联合有协同增效的潜在可能。本部分研究旨在通过两种人肝癌细胞株(SMMC-7721,SK-HEP-1)来观察索拉非尼与放射联合是否对肝癌有协同抗肿瘤效应以及可能产生协同效应的联合方式。方法：通过CCK-8法细胞毒性增殖实验绘制不同浓度索拉非尼处理48h后的肝癌细胞存活曲线,计算索拉非尼对肝癌细胞的抑制浓度(IC)。选择IC50(抑制细胞生长50%时的药物浓度)的10%作为克隆形成实验的药物浓度。通过克隆形成实验比较索拉非尼在γ线照射前/后处理与单纯放射后的肝癌细胞剂量效应曲线,计算放射增敏比。结果：SMMC-7721和SK-HEP-1细胞的IC50分别是4.82μM和9.55μM。故选用10%的IC50,即0.5μM和1μM分别作为两种肝癌细胞克隆形成实验的药物浓度。索拉非尼对两种肝癌细胞株的放射敏感性改变因索拉非尼与放射联合方式的不同而异。索拉非尼后处理(R->S)明显增加了SMMC-7721细胞的放射敏感性(SER=1.21),但几乎不改变SK-HEP-1细胞的存活曲线斜率(SER=1.00)。索拉非尼预处理(S+R)则使两种肝癌细胞的存活曲线在较高照射剂量区域的斜率都出现明显增加(β值增加),SMMC-7721和SK-HEP-1的SER分别是1.10和1.18。结论：体外实验发现了索拉非尼与放射联合对两种不同放射敏感性的肝癌细胞产生不同程度的放射增敏效应。第二部分索拉非尼对肝癌细胞放射增敏效应的机制研究目的：本部分研究旨在从细胞增殖、DNA损伤及修复、细胞凋亡等多个可能影响放射敏感性的方面,来阐述索拉非尼与放射联合在肝癌细胞中产生协同效应的潜在机制。方法：通过Westernblot方法检测索拉非尼联合放射作用于肝癌细胞对放射所诱导的细胞增殖(p-ERK1/2)、DNA损伤修复(p-Ku70、p-BRCA1)、细胞凋亡(p-NF-KB)和新生血管形成(p-VEGFR2)等多个方面的蛋白表达水平的调控。通过微核实验考察索拉非尼是否增加了放射所诱导的DNA损伤。通过AnnexinV/PI流式细胞术和caspase-3酶活性检测,观察索拉非尼对放射所诱导细胞凋亡的影响。结果：索拉非尼与放射联合作用于肝癌细胞可以有效地抑制由放射诱导的VEGFR2磷酸化及其下游信号传导通路中ERK的激活。索拉非尼与放射联合较单纯放射在肝癌细胞中增加了细胞微核率、同时又抑制双链断裂HR和NHEJ修复途径的关键蛋白BRCA1和Ku70的磷酸化表达。此外,放射所诱发的NF-KB磷酸化激活可以被索拉非尼的联合应用所抑制,索拉非尼也显著增加了放射后早期凋亡细胞比例和caspase-3酶活性。然而,SK-HEP-1细胞索拉非尼在放射后给药组在以上作用机制中均有所例外,这也正解释了这一组没有产生放射增敏的结果。结论：索拉非尼与放射联用于肝癌细胞,可以抑制放射后细胞增殖,增加放射引起的DNA损伤并抑制两种关键途径的DNA修复能力,同时促进放射诱导的凋亡。以上多种机制共同促成了索拉非尼对肝癌细胞的放射增敏作用。第三部分索拉非尼联合放射抗肝癌效应的体内研究目的：本部分实验研究旨在观察索拉非尼与放射联合在肝癌荷瘤裸鼠模型中的抗肿瘤效应。方法：通过皮下接种SMMC-7721和SK-HEP-1细胞建立肝癌的荷瘤裸鼠模型。对移植瘤进行以下分组处理：对照组、单纯放射组、放射序贯联合索拉非尼组以及索拉非尼同步联合放射组。其中,索拉非尼给药分为高剂量(100mg/kg/d)和低剂量(30mg/kg/d)。构建不同处理组不同剂量点的肿瘤生长曲线,并用Gompertz模型或Cubic模型进行拟合。以移植瘤生长达到2倍初始体积(VO)为目标效应,计算各处理组的肿瘤生长延迟天数(TGD)并用相应的对照组进行标化。根据不同的放射剂量和标化的TGD产生剂量效应曲线,计算剂量修饰因子(DMF)。结果：对于SMMC-7721移植瘤,放射后序贯联合索拉非尼延迟肿瘤生长的作用具有剂量依赖性,即随着索拉非尼剂量加大而增加(DMF最大可达1.57)；但是,索拉非尼同步联合放射在两种索拉非尼剂量水平产生相似的肿瘤生长延迟作用(DMF为1.4左右)。对于SK-HEP-1移植瘤,索拉非尼同步联合放射产生药物剂量依赖性的生长抑制作用(DMF最大可达1.82)；而放射后序贯联合索拉非尼也增加了放射的效应,但其延迟肿瘤生长的作用不随索拉非尼剂量的增加而增加(DMF为1.5左右)。结论：索拉非尼与放射联合在肝癌移植瘤中可产生显著的放射增敏效应。索拉非尼拮抗肿瘤血管及抑制新生血管形成很可能在其增加体内放射效应中发挥重要作用,但有待进一步研究证实。
【作者】余雯；
【导师】蒋国梁；
【作者基本信息】复旦大学，肿瘤学，2013，博士
【关键词】索拉非尼；放射；放射增敏剂；肝细胞肝癌；体外；细胞增殖；DNA修复；凋亡；裸鼠；移植瘤模型实验；

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