重组人死亡受体6在毕赤酵母中的表达、纯化及与淀粉样前体蛋白相互作用的研究

【摘要】阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是一种中枢神经系统变性病,起病隐袭,病程呈慢性进行性,是老年痴呆中最常见的一种类型。20世纪中叶以来,随老龄化的加快及AD发病率的增高,AD防治已成为全球关注热点。近年有科学研究发现：淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)和死亡受体6(Deathreceptor-6,DR6)在神经细胞自我毁灭的途径中发挥了作用,并且认为APP可能是DR6的配体,当营养因子缺乏时就会通过特定的凋亡受体传递某些胞外信号从而导致神经退化。DR6表达于人体大多数组织和器官,一些证据表明,DR6的表达在活化和分化过程中被调节。APP的N端片段(NAPP)与DR6之间的作用类似于抗原与抗体之间的相互作用,多种因素调节其对轴突的作用。首先受到的是神经营养因子的调节,因为神经生长因子是神经元存活和生长的重要因素,营养因子的缺乏就将导致神经元的萎缩变性,而基底前脑胆碱能神经元(BF-CN)对于神经营养因子的缺乏则更为敏感,这也是AD发生的主要原因之一。在神经营养因子被剥夺的条件下,触发胞外APP的N端片段被β-分泌酶切割后,脱落并产生了NAPP,并且与神经元和轴突表面的DR6结合,激活了依赖于caspase3和caspase6的信号通路导致神经元胞体和神经元轴突的凋亡。由于NAPP-DR6相互作用机制可以很好的解释AD病症的发展过程中神经元轴突的变性崩解,并且在体内和离体条件下神经营养因子剥夺时均有轴突变性崩解和DR6的表达上调现象,这综合表明了DR6-NAPP相互作用机制可能是导致神经元凋亡和轴突变性的调控机制。因此,探究DR6的功能以及研究NAPP-DR6的相互作用机制提供了一个新的突破口,对探索AD的发病原因、致病病理和对AD治疗药物靶标的定位以及开发新的治疗AD的药物提供了一个新的方向。本研究课题以含有DR6全长cDNA的质粒为扩增模板,PCR扩增DR6(aa42-218/aa42-349)的DNA片段,并与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,经筛选鉴定后构建成功了重组载体pPIC9K-DR6(aa42-218/aa42-349),重组载体经测序验证后电击导入毕赤酵母表达菌株GS115,得到分别表达DR6不同氨基酸片段的两个酵母重组子菌株。经过表达条件的优化实现了重组蛋白的高效分泌表达,经SDS-PAGE电泳分析,在表达上清中有相对分子量大小约为26kD和43kD的外源蛋白产生,经过Westernblot检测证明其为目的蛋白。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,成功构建了pGST-DR6(aa42-349),还纯化得到DR6的配体NAPP,GSTpull-down结果显示两者存在体外相互结合.本实验成功构建了人DR6(aa42-218/aa42-349)的毕赤酵母真核表达载体并实现了高效分泌表达,初步证明了重组DR6和NAPP的体外相互作用,为下一步研究DR6的生物学功能及APP与DR6的相互作用域及相互作用关键残基奠定了基础。
【作者】李伟；
【导师】刘堰；
【作者基本信息】西南大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【关键词】死亡受体-6；毕赤酵母；分泌表达；pull-down；相互作用；

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