电针的抗抑郁作用及其促海马神经干细胞增殖的相关机制
【摘要】电针的抗抑郁作用及其促海马神经干细胞增殖的相关机制抑郁症已成为危害当今社会健康的重要问题。在世界范围内,平均11%人群遭受抑郁症的困扰,由此带来的人身及经济损失不计其数。尽管通过抗抑郁药的治疗可以改善部分病人的抑郁症状,达到好转或治愈的疗效,但仍有30%左右的患者呈现抗抑郁药抵抗,并且抗抑郁药毒副反应大,起效慢,抑郁症复发率很高。与常规抗抑郁药物治疗相比,针刺疗法,已不断被证实,具有安全有效、副作用少的优势。在我国,许多病患都已开始接受电针治疗；同时,研究者也逐步关注和认同了电针对抑郁症的改善作用。但对于针刺疗法的相关中枢机制,不同研究者观点和流派也各异,仍需深入探讨。近年来,一种机制被研究人员多次提及,即电针对抑郁等精神疾病的治疗作用,可能和改善中枢神经干细胞的存活和增殖有一定关系。不过,涉及到电针影响中枢神经干细胞的增殖或分化水平,及相关细胞亚类、信号转导通路等研究的证据尚不充足。此前研究提示,成年海马的齿状回部位存在大量未分化状态的神经干/祖细胞,因此,该区域对中枢的神经再生有极其重要的意义,并在抑郁症发病与治疗中具有重要作用。慢性应激刺激能逐步降低神经的再生能力(也就是说,慢性应激刺激能一定程度影响神经干细胞功能)。曾有研究学者将神经干/祖细胞分为两大类：静息类神经干/祖细胞(quiescentneuralprogenitor,QNP)和增殖类神经干/祖细胞(amplifyingneuralprogenitor,ANP)。两类细胞都具有干细胞的免疫染色特点——即Nestin和SOX-2免疫阳性染色,前者有基底形态和明显的树状分支到颗粒细胞层,并且具有一定的星形胶质细胞属性,能表达GFAP(并有学者表明,此类细胞分化/或功能丧失而“丢弃化”后,即成为无明显特征功能的星形胶质细胞)；而_AAP则不表达GFAP。已有研究表明,QNP与ANP在响应外界刺激和治疗效应的敏感度和专属性差别很大,以至于不少中枢疾病,存在涉及不同的细胞亚类的机制。那么,抑郁症状态下,究竟哪一类干细胞成为病理因素的主要对象,电针的抗抑郁效果,又和哪一类干细胞的激活相关,目前尚无充足的研究结论。基于此,我们首先探究了电针对慢性不可预知刺激(CUS,一种广泛使用且经充分验证的抑郁症动物模型)诱导的大鼠抑郁模型抑郁样行为的改善作用。继而探究电针对CUS大鼠海马齿状回神经干细胞增殖的作用,同时,分别检测了QNP和ANP细胞亚类在抑郁症中经电针处理后的变化,以便于阐明哪一类细胞亚类是电针抗抑郁作用更偏重的对象。此外,电针改善抑郁症及海马神经干细胞增殖的相关信号转导通路,研究并不多见。在神经再生和神经干细胞增殖水平,众所周知,很重要的一类信号通路,是胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)通路,如电针上调了神经干细胞增殖水平,那么电针上调活化ERK信号通路的可能性很大。同时,考虑到已有研究显示,电针可上调一些神经营养／生长因子的水平,而这些因子对神经干细胞的生存与分裂有很大相关性。而另一方面,已有研究显示,ERK通路和这些因子的作用发挥又有着极大关联。因此,神经干细胞内的ERK通路很可能介导电针改善抑郁模型动物的抑郁样行为以及促进干细胞增殖的作用。基于此,我们又检测了神经干细胞在抑郁或电针治疗状态下,海马齿状回区干细胞中磷酸化ERK(p-ERK)的水平,以初步揭示电针影响抑郁症状态下神经干细胞所涉及的胞内信号转导通路。除此以外,为了进一步支持电针上调海马齿状回神经干细胞的生存增殖能力和ERK信号通路活化水平,是与电针改善了神经干细胞生存增殖的海马齿状回的客观物质的微环境相关,本实验进而通过海马齿状回微透析技术,收集不同处理组海马齿状回的细胞外液,并分别添加至不同组神经干细胞培养基中,测试不同的微透析液对体外培养的干细胞增殖能力、干细胞球生长扩大能力以及体外干细胞p-ERK水平的影响。以上各点实验结果如下：1.电针改善CUS模型大鼠的抑郁样行为SD大鼠分为4组：正常组(Normal)、CUS模型组(Model,后文简称模型组)、CUS+假电针治疗组(ShamEA,后文简称假电针组)和CUS+电针治疗组(EA,后文简称电针组)。CUS造模过程为,经长时间暴露在一系列随机排序的不良刺激之下,造成啮齿类动物神经行为的紊乱,以模拟人类的抑郁综合征。CUS两周后,模型组大鼠的一般状态评分(皮毛洁净度)显著下降；强迫游泳测试中,模型组静止不动时间显著上升,挣扎时间显著下降,呈现出显著地绝望行为,而造模以前,两组(正常组、模型组)无差异；高架十字迷宫实验显示,模型组大鼠的开臂进入次数百分比和开臂停留时间百分比相比正常组显著下降,模型大鼠对开臂偏好的显著下降,表现出显著的抑郁状态下焦虑行为。敞箱实验结果表明,模型组大鼠相比正常组,垂直运动次数显著下降,而水平位移没有显著差异,提示了模型大鼠探究行为的丧失,而活动度并无显著变化。两周CUS后,予以电针(以及假电针)治疗,取穴为百会穴(Du-20)、阳陵泉(GB-34),为期两周,共8次治疗。强迫游泳实验结果：电针组与假针组静止不动时间明显低于模型组,恢复到正常组相似水平；电针组挣扎时间与模型组相比显著增加。提示：电针在强迫游泳实验中显示了对抗抑郁的效果。假电针也意外的显示出一定的对抗抑郁效果,尤其在静止不动时间指标上,但不如电针稳定和明显。高架十字迷宫实验结果表明：电针能改善暴露CUS刺激后的焦虑样行为,电针组开臂进入次数百分比和开臂进入时间百分比显著高于模型组。在敞箱实验中,电针组和假针组在治疗早期阶段,垂直运动次数就显著增加,提示针刺改善了大鼠由CUS引起的探究行为下降。以上行为学结果证实了电针可显著改善CUS模型大鼠的抑郁样行为。2.电针提升海马齿状回神经干细胞中BrdU阳性细胞数免疫荧光统计结果显示：电针组经2次治疗后,即能显著提升海马齿状回区域内BrdU/SOX-2双标阳性细胞数,达到正常组水平；而假电针组双阳性细胞数也得以显著增加。经2周(8次)治疗后,电针组BrdU/SOX-2双阳性细胞数显著高于模型组,假针组与模型组没有显著差别。此结果提示,电针可显著改善由CUS抑制的中枢海马神经干细胞增殖水平。3.电针处理对大鼠海马内QNP和ANP的数量影响4周CUS以后,与正常组大鼠相比,模型组大鼠海马静息类神经干细胞QNP(SOX-2+/GFAP+)水平未发生显著性变化,而增殖类神经干细胞ANP(SOX-2+/GFAP-)数量显著下降。经8次电针或假电针治疗后,ANP水平均得到提高。而电针组干细胞总数高度显著性高于模型组(其中,除ANP数量高于模型组外,QNP数量也显著高于模型组)。假针组QNP水平与模型组无差异。此结果提示,针刺(不管通电与否)对海马ANP均有一定的益化／生成作用；而电针则不但影响ANP,还具有保护或提升QNP数量的作用。这种电针的保护或提升干细胞数量的作用,可能包含针刺作用和电流通过穴位作用两层意义,并且两种细胞亚类均可响应。4.电针处理促进干细胞中ERK通路的活化以电针上调干细胞增殖或数量的结果为基础,继而观察不同处理组海马齿状回干细胞中p-ERKl/2的水平。免疫荧光结果显示,针刺治疗后,干细胞内p-ERK的水平显著上调——电针组p-ERK/Nestin双标细胞数量显著高于模型组。这一结果提示：电针活化干细胞增殖及伴随改善抑郁样行为的作用,可能与其上调MAPK/ERK信号通路相关。5.电针微透析液上调体外干细胞神经球的生长与神经干细胞p-ERK水平首先,SD大鼠经CUS处理和电针治疗,收集5次电针治疗后,电针组与模型组大鼠海马齿状回的微透析液。其次,从新生SD鼠海马中,提取和纯化神经干细胞,经过9天纯化并鉴定。将纯化的神经干细胞继而进行差异化培养基培养——不同培养基分别添加电针大鼠或模型大鼠海马齿状回微透析液。连续7天后,用CCK-8法测试细胞活力,并计算固定体积中“大神经球”(直径不小于100μm)的数量。结果表明,电针微透析液培养基对体外培养的神经干细胞活力(或细胞数量)并无显著提升,但显著增加了“大神经球”的数量。成神经球是神经干细胞培养的特征属性,非成球态神经干细胞往往分化贴壁甚至凋亡,促进成球性,说明电针微透析液具有维持或保护神经干细胞属性的作用。此外,我们又对7天差异培养后的神经干细胞进行分散和固定,用免疫组化方法考察干细胞p-ERK水平,结果显示,电针微透析液培养基组p-ERK阳性细胞数明显高于模型微透析液培养基组。进一步提示：电针改善了大鼠海马细胞外液微环境,该微环境通过ERK信号通路活化干细胞,发挥在干细胞层面的抗抑郁作用,此结果与前文在体结果相一致,并从一定方面阐述了电针的抗抑郁机制。结论1.电针具有改善CUS诱导的抑郁大鼠的抑郁样行为的作用；2.CUS诱导的大鼠抑郁模型海马齿状回中神经干细胞总数下降；3.电针的抗抑郁作用和它同时提升静息类神经干细胞与增殖类神经干细胞数量有密切关系,无电流作用的假电针则仅具有提升增殖类神经干细胞数量的作用；4.电针促进CUS抑郁大鼠海马齿状回神经干细胞增殖伴随了活化干细胞内ERK信号通路的作用。5.电针微透析液可促进离体神经干细胞球的生长和离体干细胞内ERK信号通路的活化,电针抗抑郁作用与电针改善神经干细胞胞外海马微环境相关。
【作者】杨柳；
【导师】吴根诚；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合基础，2012，博士
【关键词】抑郁症；电针；神经再生；神经干细胞；p-ERK；ERK1/2；海马齿状回；微透析；
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