MPTP调节海马突触传递和活性依赖可塑性的细胞机制研究

【摘要】帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是仅次于阿尔茨海默氏病的第二大神经退行性疾病。传统观念认为帕金森病仅仅是一种运动功能障碍的疾病,主要症状包括静止性震颤、僵直、运动徐缓。认知功能障碍伴随着PD的发生,并给患者本身和看护者带来更为沉重的精神和社会负担。记忆的形成对于认知功能的发挥有着举足轻重的作用。考虑到海马突触传递和活性依赖的突触可塑性是陈述性记忆形成的重要细胞模型,在PD发生过程中海马突触传递和活性依赖的可塑性是否发生改变是PD研究的一个有兴趣的课题。杀虫剂、除草剂中主要化合物鱼藤酮、百草枯的广泛使用与帕金森病的发生具有密切相关性。1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)是一种结构类似于百草枯的神经毒素,能通过多种方式进入机体引起灵长类和啮齿类动物典型PD症状,包括运动功能障碍和非运动功能障碍。因此,MPTP被广泛用来制作PD动物模型,用来研究PD的发生机制及筛选相应保护策略。对于MPTP的研究,目前主要集中在阐明该毒素诱导多巴胺能神经元死亡及相关的调控机制。尽管MPTP能引起动物认知功能障碍,但是可能性的机制仍不明了。本论文第一部分探索相对低浓度MPTP对急性分离的海马脑片突触传递和活性依赖可塑性的作用,研究MPTP对海马生理功能的急性影响,并分析可能性作用机制；第二部分通过系统注射MPTP,检测黑质致密部多巴胺能神经元的的退行以及多巴胺的含量验证PD模型的制作,通过分离急性活体脑片,分析MPTP对海马突触传递和活性依赖的突触可塑性的影响。第一部分急性使用MPTP通过多巴胺受体调节海马突触传递和活性依赖的突触可塑性MPTP暴露后在海马部有较高的积聚,同时在PD发生的早期(未见多巴胺能神经元退行)动物即表现出轻微认知功能障碍。考虑到海马突触传递和活性依赖的突触可塑性在学习记忆功能发挥中扮演关键性的角色。因此,低浓度的MPTP(不足以引起细胞死亡的浓度)对海马突触传递和活性依赖的可塑性就可能有一定的影响,从而引起PD早期认知功能障碍的发生。本研究通过分离急性海马脑片,制作MPTP对海马突触传递和活性依赖可塑性直接影响的细胞模型。急性分离的海马脑片孵育MPTP30min后洗脱,50-100μM能引起AMPA(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionatereceptor)受体依赖的兴奋性突触后场电位(fieldexcitatorypostsynapticpotatials,fEPSPs)和N-methyl-D-asparticacidreceptor(NMDA)受体依赖的fEPSP的短暂增强,60min后出现浓度依赖的突触传递抑制,25μMMPTP仅能引起AMPA受体依赖的fEPSP的短暂增强后并维持在基线水平,同时能引起NMDA受体依赖的fEPSP的长时程增强。为分析相关的作用机制,后续实验选取两个不同浓度(25μM和75μM)分别研究MPTP对海马突触传递和活性依赖可塑性的影响并探索相关机制。25μMMPTP引起的AMPA受体依赖的fEPSP的短暂增强被多巴胺D2样受体抑制剂sulpiride(1μM和40μM)或eticlopride(1μM)阻断,同时该浓度的MPTP能引起双脉冲易化(PPF)的降低和兴奋性突触后微小电流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrent,mEPSC)频率的降低。25μMMPTP作用后使得单次高频刺激诱导的STP转化为LTP；3次高频刺激诱导LTP的表达未发生典型的变化,然而突触通道特异性却发生破坏。此外,长时程增强的通道特异性的破坏可以被NMDA受体或多巴胺D1/D5受体抑制剂SCH23390(10μM)改善。75μMMPTP诱导的突触传递的改变可以被多巴胺D2样受体抑制剂sulpiride阻断；Proteintyrosinephosphatase(PTP)抑制剂能增强MPTP对突触传递的影响；Proteintyrosinekinase(PTK)抑制剂能逆转MPTP诱导的突触传递的改变。考虑到GroupImetabotropicglutamatereceptors激动剂3,5-dihydroxyphenylglycine(DHPG)诱导的LTD是蛋白酪氨酸磷酸化依赖的突触前抑制,本实验考查了DHPG和MPTP交互作用.DHPG(40诱导LTD后,灌入75μMMPTP后,突触传递抑制进一步加剧。然而25μMMPTP的预先作用却能阻断DHPG诱导的LTD的表达。此外,LTP的诱导中激活的相关信号通路并不能阻断MPTP对突触传递的影响。本项目的研究指出,MPTP能够通过多巴胺受体和蛋白酪氨酸激酶／磷酸水解酶,调节突触前递质的释放而影响突触传递。同时,MPTP对突触后的多巴胺受体及NMDA受体也有一定的调节作用,并通过多巴胺D1/D5受体和NMDA受体调节LTP诱导的阈值,破坏LTP表达的通道特异性。第二部分系统注射MPTP诱导的多巴胺分泌降低对海马CA1区突触传递和活性依赖的突触可塑性的影响MPTP在脑内的积聚可能造成细胞的死亡,尤其黑质致密部多巴胺能神经元；多次系统注射MPTP能够诱导PD类似的症状包括学习记忆功能的改变,但是可能性的机制尚不清楚。本研究通过系统注射MPTP(连续四次,每次20mg/kg间隔2小时)制作PD模型,结果显示MPTP作用7天后,较生理盐水对照组,黑质致密部Tyrosinehydroxylase(TH)阳性细胞数发生显著降低；黑质部和海马部TH　mRNA的表达也显著降低；海马和纹状体内多巴胺(dopamine,DA)和它的代谢物DOPAC的含量均发生显著性的降低；海马内DA的降低并不能引起海马Schaffercollateral-CA1基础传递的改变,但是降低30ms间隔的双脉冲易化。和生理盐水对照组相比较,3次高频刺激诱导的LTP发生显著的降低,而低频刺激诱导的LTD的表达却得到增强。LTP和LTD的表达都依赖于NMDA受体和多巴胺受体的激活。为此,本研究通过使用AMPA受体抑制剂分离NMDA受体依赖的突触传递,MPTP注射后7天,较生理盐水对照组,NMDA受体依赖的突触传递减少了约23%。在LTP诱导过程中,通过单独使用NMDA受体抑制剂AP5(20%抑制NMDA受体)并不能模拟出MPTP处理组的LTP。但是,在高频刺激期间,同时抑制多巴胺D1/D5受体和部分抑制NMDA受体能够模拟出MPTP腹腔注射后LTP的破坏。因此,MPTP作用后,LTP的降低可能和多巴胺受体及NMDA受体部分抑制相关。本研究的数据表明,MPTP诱导的多巴胺能神经元的退行和海马内DA的降低能够改变NMDA受体调节的突触传递和活性依赖的突触可塑性。本论文通过体外脑片孵育和系统注射MPTP,分别阐述了MPTP对海马突触传递和活性依赖可塑性的短时和长效作用,该研究对于揭示神经毒素诱导的帕金森病发生过程中的认知功能障碍的发生及其机制的阐明有着重要的意义,并为筛选有效的保护PD认知功能障碍的药物提供了不同的研究模型。
【作者】朱国旗；
【导师】ThomasBehnisch；
【作者基本信息】复旦大学，神经生物学，2012，博士
【关键词】帕金森病；MPTP；海马；突触传递和可塑性；多巴胺能神经元；

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