大豆Gmubi和马铃薯Patatin2启动子在芥菜中的表达分析

【摘要】植物基因工程技术作为一种改良品种性状的辅助手段,能够加快选育的进程。在植物基因工程的研究中,除了优良基因的分离与克隆外,调控外源基因的表达的启动子也是重要研究的研究课题。启动子能够在转录水平上参与调控下游基因表达,从而得到能够抵御外界环境的胁迫、抗逆性增强和营养价值更高的植物新品种。植物基因工程中,往往需要目的基因在受体植物中大量高效表达。目前,在转基因植物研究中,大多数使用组成型启动子如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和从木薯叶脉花叶病毒中分离的CsVMV启动子。然而,在利用基因工程对植物进行改良的过程中,有时需要同时引入多个基因实现对某特定性状的控制,这无疑将使用到多个启动子。因此,人们需要去寻找更多有效的组成型启动子,实现植物复杂性状的人工调控。另外,为实现外源基因在特定的部位或器官中表达,需要大量用到组织特异性启动子或器官特异性启动子。该类启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累,增加区域表达量,同时也可以避免过度的消耗细胞内的物质与能量而对植物自身的生长发育带来不良的影响。针对上述情况,本论文将从植物大豆中克隆得到的Gmubi组成型启动子,从马铃薯中克隆得到Patatin2特异性启动子,与GUS基因融合分别构建以Bar基因(对除草剂Basta具有抗性)为筛选标记的植物表达载体pCABarGmubiGus和pCABarPatatin2Gus,通过农杆菌介导法导入渝丰芥菜,研究两个启动子在异源生物中的表达特性,为今后利用上述启动子在植物中进行基因功能分析以及转基因植物的开发奠定基础。具体获得的结果如下：1.Gmubi启动子的克隆及功能分析载体构建根据NCBI数据库中已经公布的大豆polyubiquitin(ubi)基因启动子序列(EU310508.1),设计引物从大豆DNA中扩增到大小约0.9kb片段,克隆到pBluescript载体上进行测序验证。序列分析显示扩增到的序列长度为917bp,与EU310508.1目标序列有7个核苷酸不一致,序列一致性为99%。用HindⅢ+Ncol酶切下917bp的Gmubi替换载体PCABarGus中的35S启动子,获得表达载体PCABarGmubiGus。2.Patatin2启动子的克隆及功能分析载体构建根据NCBI数据库中已经公布的马铃薯PatatinClassII启动子序列(X60398.1),设计引物从马铃薯DNA中扩增到大小约0.7kb片段,克隆到pBluescript载体上进行测序验证。序列分析显示扩增到的序列长度为669bp,与X60398.1目标序列有4个核苷酸不一致,序列一致性为99%。用HindIII+NcoI酶切下677bp的Patatin2替换载体PCABarGus中的35S启动子,获得表达载体PCABarPatatin2Gus。3.农杆菌介导法获得转基因芥菜植株利用农杆菌介导法,将构建的两个植物表达载体pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus和阳性对照pCABar35SGus用农杆菌介导转化“渝丰”榨菜下胚轴,通过PPT(phosphinothricin,膦丝菌素)的多轮筛选获得转基因芥菜植株。4.转基因芥菜植株的分子检测提取转基因植株DNA用相应的引物进行PCR扩增。用Gmubi启动子引物从10株pCABarGmubiGus除草剂抗性植株中检测到6株抗性植株含有Gmubi启动子序列。用HPatatin2启动子引物从10株pCABarPatatin2Gus除草剂抗性植株中检测到5株抗性植株含有Patatin2启动子序列。5.pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus转基因植株GUS组织化学分析pCABar35SGus对照转基因芥菜植株叶、茎、花、种子、根均具有很强的GUS活性,而非转基因野生型芥菜叶、茎、花、种子、根均无GUS活性。pCABarGmubiGus转基因芥菜植株的叶、茎、花、种子、根均具有很强的GUS活性,表明Gmubi启动子能够在芥菜中组成型表达。然而,对获得的所有pCABarPatatin2Gus转基因芥菜叶、茎、花、种子、根进行GUS组织化学分析,结果均未检测到GUS活性的表达,显示来自马铃薯的茎特异表达启动子Patatin2无法驱动外源基因在芥菜中的表达。
【作者】梁平；
【导师】宋洪元；
【作者基本信息】西南大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】Gmubi启动子；Patatin2启动子；芥菜；GUS组织化学分析；

【参考文献】
[1]鲍宗泛.广域网数据库查询系统的研究与开发[D].浙江大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[2]于晓青.司法裁判中的法理与民意[J].法商研究,2012,05:134-141.
[3]解金山,赵玉兰,杨邦湘,桂厚义.发展光纤用户网应采取的技术政策和措施[J].现代电信科技.1994(09)
[4]李世清.蒸发冷却介质凝结传热特性测试平台的研制及相关实验研究[D].中国科学院研究生院（电工研究所）,电机与电器,2004,硕士.
[5]谢小红,魏子栋.通过载体提高燃料电池催化剂的稳定性[J].电化学,2015,03:221-233.
[6]孙桂华.集散控制系统和上位计算机间数据通讯的设计剖析[J].冶金自动化,1994,03:31-34+56.
[7]章婧.拒水拒油型聚氨酯树脂的制备及性能评价[D].武汉纺织大学,纺织化学与染整工程,2014,硕士.
[8]张志刚.滴灌条件下土壤水分运移规律研究[D].新疆师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[9]于瑶.第三人利益合同制度的法理问题研究[D].吉林大学,法学理论,2013,硕士.
[10]刘烨斐.电力负荷分配与电煤存储裕度预警的研究[D].华中科技大学,系统工程,2013,硕士.
[11]贠惠娜.基于三角模糊数-TOPSIS法的高速公路穿越高铁施工方案比选研究[D].西安建筑科技大学,土木工程建造与管理,2013,硕士.
[12]罗哲林.富CO_2烟气压缩一体化脱硫脱硝的实验研究[D].华中科技大学,热能工程,2013,硕士.
[13]彭淑君.晋中黄土湿陷特性研究[D].西北大学,地质工程,2014,硕士.
[14]庄林.近期热点文章[J].电化学,2014,02:194-195.
[15]莫丽敏.扶持人口较少民族发展政策研究[D].广西民族大学,马克思主义民族理论与政策,2013,硕士.
[16]张寒.基于图形化衬底的石墨烯定点制备及应用研究[D].北京交通大学,2014.
[17]辛云.蒽醌氨基酸化合物的合成[D].河北师范大学,有机化学,2004,硕士.
[18]陈亮.基于CPLD的车载激光测距系统研究[D].华中科技大学,光电信息工程,2013,硕士.
[19]陈士光.牛磺酸及厄贝沙坦对链脲佐菌素致胰岛β细胞损伤的保护作用[D].广西医科大学,内分泌,2013,硕士.
[20]张静.稀土卤化物相图的热力学优化与计算[D].安徽师范大学,物理化学,2004,硕士.
[21]王新亭.复合染料及其双膜片敏化工艺研究[D].燕山大学,化学工程,2012,硕士.
[22]赫笑然.自适应温度补偿超高精度FBG传感系统[D].哈尔滨工业大学,物理电子学,2013,硕士.
[23]娄丽雯.概念整合理论下中美脱口秀言语幽默分析[D].浙江工商大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[24]常云霞.场放大样品进样毛细管电泳法检测苯二胺及人工色素研究[D].吉林大学,分析化学,2013,硕士.
[25]皮兴兰.商品房买卖合同适用情事变更原则研究[D].安徽大学,法律,2014,硕士.
[26]张松.CD105靶向金磁纳米粒的合成及其对乳腺癌血管生成的MRI和CT实验研究[D].第三军医大学,影像医学与核医学,2014,博士.
[27]王永强.皮秒—亚皮秒锁模光纤激光器和超连续谱产生的研究[D].天津大学,物理电子学,2004,硕士.
[28]王静.幼师生心理适应状况的调查研究[D].内蒙古师范大学,心理健康教育（专业学位）,2013,硕士.
[29]魏华祝.模拟长时间网球比赛中正手击球臂运动肌群的肌电变化特征[D].湖南师范大学,运动人体科学,2014,硕士.
[30]高欢欢.Tristetraprolin和VEGF家族的表达异常参与腹膜透析大鼠超滤衰竭的发生[D].郑州大学,内科学,2013,硕士.
[31]陈亮,胡昌华.基于退化建模的可靠性分析研究现状[J].控制与决策,2009,09:1281-1287+1293.
[32]邱小艳,燕良轼.论农村殡葬礼俗的心理治疗价值——以汉族为例[J].中国临床心理学杂志,2014,05:944-946+929.
[33]韦沛.基于GEO通信卫星的转发式共视授时方法[D].中国科学院研究生院（国家授时中心）,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[34]吴汝正.电缆屏蔽层对地故障点的探测[J].冶金自动化,1987,03:54-56.
[35]谭勇刚.当代都市佛教题材绘画艺术风格研究[D].西南大学,美术学,2014,硕士.
[36]李根.深冷处理和攻丝过程中丝锥应力场的数值模拟[D].太原科技大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[37]邝继双.基于GIS组件的农田空间信息管理系统的开发研究[D].中国农业大学,2003.
[38]葛宏松.中国汉族人寻常型银屑病与HLA单倍型相关性研究[D].安徽医科大学,皮肤性病学,2003,硕士.
[39]曾靖.基于复杂加权网络模型的电网连锁故障研究[D].兰州理工大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[40]谢小添.绿色专利制度下的汽车零部件再造问题研究[D].华中科技大学,民商法学,2013,硕士.
[41]王亚静.尼古丁在巨噬细胞介导下对血管内皮细胞粘附分子表达的作用[D].山西医科大学,病原生物学,2003,硕士.
[42]杨卉.SnO_2基乙炔气敏元件的研制[D].吉林大学,集成电路工程,2013,硕士.
[43]戚永娟.基于动态体模的CT时间分辨力的测试方法研究与实践[D].南方医科大学,生物医学工程,2012,硕士.
[44]李宏,焦永昌,张莉.一种求解混合整数规划的混合进化算法[J].控制与决策,2008,10:1098-1102.
[45]姚姚.用扩展τ-p变换实现倾角时差校正(DMO)[J].石油地球物理勘探,1987,03:249-258.
[46]贺旸.赵孟頫美学思想探微[D].首都师范大学,美学,2014,硕士.
[47]岳林凯.基于市场导向与组织绩效直接作用关系的Meta分析[D].南京大学,企业管理,2012,硕士.
[48]冒宇清,唐晓莉,姜彬.基于SVG/WebService的Web监控技术在EMS中的应用[J].电力系统自动化,2007,04:91-96.
[49]王群,莫军军,戴新娥,倪玲美.医院消毒供应室品管圈活动在降低条形码错误数量中的应用[J].浙江预防医学,2014,10:1050-1051+1054.
[50]陈含影.支架式作文教学在落后山区中学实施的可行性分析[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.