噬菌体phiC31/att位点重组系统介导的基因倒位和删除研究

【摘要】在植物转基因研究中,可以通过建立“基因开关”的方式实现目标基因表达的人工调控。位点重组酶系统中的重组酶可诱导相应特异重组位点间的基因序列发生重组,依据重组位点的排列方向,重组后将导致重组位点间的基因片段发生整合、删除以及倒位,该特点为“基因开关”的设计提供了可能。本实验研究的phiC31/att重组酶系统由613个氨基酸构成的重组酶phiC31和相应的识别位点attP及attB组成,由于重组位点attB与attP为非同源序列,发生重组后,产生不被重组酶phiC31识别的新的重组位点attR和attL,即重组反应不可逆向进行,因此可在植物转基因中利用该重组酶系统诱导的单向重组反应实现“基因开关”的“锁定”。目前,针对phiC31/att重组酶系统的研究主要集中于基因整合、删除领域,就其介导的基因倒位研究鲜有报道。因此本实验构建了表达重组酶phiC31的原核表达载体PACYCNC31-1以及植物表达载体PCA23C31及PCA23NC31,并同时构建了重组酶结合位点attB与attP以不同排列方式的原核表达载体PE35SattB-H、PE35SattB-T和PEBar-D以及植物表达载体PCABARattB-GUS、PCA13attB-BAR、PCA13attB-BT、PCA13BARattBoMYB2和PCA1335SBARattBoMYB2,分别在原核生物和植物中验证phiC31重组酶介导的基因倒位与基因删除功能,为今后在植物转基因中利用phiC31/att位点重组系统系统建立稳定的“基因开关”以实现外源基因表达的精确调控提供实验依据,实验所获得的结果如下：(1)原核表达载体PACYCNC31-1分别与PE35SattB-H、PE35SattB-T及PEBar-D共转化,IPTG诱导下在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中共表达,用引物35S-F、Nos-R以及C311、C31-4对Amp+Cam+LB固体培养基上获得的双抗性菌斑和相应质粒进行PCR鉴定,结果表明在大肠杆菌中不含有密码子的重组酶基因phiNC31能够表达重组酶phiC31并诱导同向排列的attB与attP重组酶结合位点间的Bar-E9基因序列发生删除,同时可诱导“尾对尾”相对排列的attB与attP重组酶结合位点间35S启动子发生倒位,但以“头对头”方向排列的attB与attP重组酶结合位点间的DNA片段不能发生倒位。(2)分别以GUS、Bar、BT(MYB+TT8,色素表达融合基因)为报告基因,通过农杆菌介导的共转化或二次转化的方式将重组酶基因phiC31(含内含子序列)以及phiNC31(无内含子)与“头对头”排列的重组酶结合位点attB与attP导入芥菜和烟草细胞中,对获得的转基因植株叶片进行组织GUS染色、PPT抗性鉴定、PCR鉴定及克隆测序,均未获得重组位点间35S启动子发生倒位的实验证据。结果表明：重组酶phiC31无法诱导以“头对头”排列方式重组位点attB与attP间的35S启动子发生倒位从而使原来“关闭”的报告基因“打开”。(3)以BoMYB基因为报告基因,通过农杆菌介导共转化的方式将PCA23C31和PCA23NC31分别与PCA1335SBARattBoMYB2(结合位点attB与attP同向排列)导入到烟草细胞中,在筛选培养上获得了色素基因表达的红色愈伤组织,证明位于BoMYB基因上游的Bar-E9阻止元件被成功删除。进一步用引物35S-1和BoMYB-R2对共转化获得抗性愈伤组织DNA进行扩增,得到预期Bar-E9基因片段删除后约1.0kb目的条带,目的条带克隆测序后获得的948个碱基序列中找到预期发生重组后包含部分attB54与attP57的新重组位点attR(55bp)。结果表明插入内含子序列的重组酶基区|phiC31可在烟草植物中正确剪切表达重组酶,并精确诱导同向排列的attB与attP位点之间“封阻基因’’Bar-E9序列删除,使得重组前处于“关闭”状态的BoMYB基因在35S启动下“打开”。由于时间关系,attB与attP”尾对尾”排列下重组酶phiC31诱导的基因倒位功能在烟草中验证的实验正在进行中。
【作者】邹丽婷；
【导师】宋洪元；
【作者基本信息】西南大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】phiC31/att位点重组系统；基因倒位；基因删除；基因开关；芥菜；烟草；

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