肺脏特络细胞（telocytes）的研究

【摘要】特络细胞(telocytes)是近几年新发现的一种间充质来源的间质细胞,由罗马尼亚L.M.Popescu教授在2005年首次确认,并于2010年正式命名。特络细胞已被证实存在于哺乳动物体内几乎各种器官及组织中。特络细胞形态及超微结构与其他间质细胞如成纤维细胞、间充质干细胞等有着显著不同,其具有特征性的串珠样细胞突起,可形成3D网络支架结构。通过组织学和免疫学的方法已经证实特络细胞表面阳性表达CD34、c-kit、vimentin,与各种固有细胞如成纤维细胞、免疫细胞、神经细胞等互相接触,参与细胞间的信号转导,尤其是与干细胞关系密切,可能发挥着“干细胞辅助细胞”的功能参与组织的损伤修复过程。但是限于在细胞分离、纯化、培养等方面的诸多困难,对特络细胞功能学的研究非常缓慢,目前大多数研究仅局限于组织学及形态学方面,仅有少数专注于细胞生物学功能方面的研究,而且还只是基于细致的组织学观察而得出的推论和假设,尚缺乏体内、体外的细胞实验进行论证。我们认为某种细胞的结构及其组织分布特征必然与其功能相适应,因此在现有的研究基础上,本课题应用组织学、细胞分子生物学、基因组学等方法,着重研究特络细胞在肺脏的定位和分布特征,揭示肺脏特络细胞与其他间质细胞的差异,以及与干细胞的联系,阐述其可能的细胞生物学功能,为进一步应用特络细胞治疗肺部疾病奠定理论依据和实验基础。第一部分肺脏特络细胞的定位与分离培养目的：明确特络细胞是否存在于肺脏中,揭示特络细胞在气管和肺组织中的分布特征,研究特络细胞的形态学特征及体外培养的动态变化。方法：通过电子显微镜技术、免疫组织化学技术在肺组织中定位特络细胞；体外分离小鼠/人肺特络细胞,通过原代细胞培养、活细胞染色等观察肺特络细胞的形态结构；通过Cell-IQ活细胞工作站动态观察肺特络细胞在体外培养过程中的形态学变化；采用流式细胞技术分析特络细胞的表面生物标记物。结果：扫描及透射电镜在小鼠气管软骨、平滑肌之间的间隙中找到了特络细胞,其胞体带有细长的突起telopode;透射电镜发现特络细胞位于肺间质,紧邻毛细血管及小支气管,在肺干细胞周围存在大量特络细胞。Telopode呈管腔样结构,厚薄交替。免疫组化证实特络细胞是CD34、c-kit、vimentin阳性细胞。从肺组织中分离、培养的细胞具有典型的特络细胞特征。流式细胞检测分析发现,人肺特络细胞表面CD44,CD73,CD90,CD105为阳性,CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR表型结果均为阴性,与人骨髓间充质干细胞表型一致。体外细胞培养96小时的连续动态观察提示特络细胞具有游走性、趋化性,细胞间可形成网状结构,可释放颗粒物质,也可以吞噬其他特络细胞释放的颗粒物质。结论：气管和肺组织中也广泛存在特络细胞,其分布具有特征性,参与小血管和小支气管的支架结构,与肺泡上皮细胞以及肺干细胞关系密切。人肺特络细胞与人骨髓间充质干细胞表达相同的生物标记物,特络细胞具有干细胞的特性。特络细胞之间可以形成网状结构,可能参与细胞间的信号传递。第二部分肺脏特络细胞与纤维细胞、间充质干细胞的基因差异分析目的：探索特络细胞与其他间质细胞之间的基因差异,找出其特异性表达的基因,明确特络细胞是否为一类新的间质细胞。方法：分离、培养小鼠肺特络细胞,与小鼠肺成纤维细胞、骨髓间充质干细胞一起分别做全基因表达谱分析,对比三种细胞之间的基因表达,寻找其中的差异基因和共表达基因。结果：与小鼠成纤维细胞、骨髓间充质干细胞相比较,小鼠特络细胞有2000个基因高表达,有超过4000个基因低表达。在这数千个基因中,三种细胞共同表达的基因有156个,进一步通过StringNetwork分析发现其中又有46个基因之间有不同程度的关联性,而小鼠特络细胞特异性表达Rbp1基因。差异基因主要体现在细胞的发生、生长过程,解剖与形态结构等方面。结论：特络细胞的基因表达与成纤维细胞、骨髓间充质干细胞差异巨大,尤其是特异性表达Rbp1基因。特络细胞是一类新的间质细胞第三部分肺脏特络细胞对血管内皮细胞的损伤修复作用目的：探索特络细胞是否能够合成分泌与血管生成相关的细胞因子,研究特络细胞是否能促进血管内皮细胞的增殖,促进血管内皮细胞的损伤修复。方法：分离、培养小鼠/人肺特络细胞,分别培养24、48小时,用ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子VEGF,EGF,TNF-α,IFN-γ,GM-CSF,MCP-1,TIMP-1,TIMP-2水平；分别以DMEM完全培养基和特络细胞条件培养基培养人肺微血管内皮细胞,检测细胞增殖能力；以脂多糖刺激人肺微血管内皮细胞,分别以DMEM完全培养基和特络细胞条件培养基培养,用Matrigel胶法检测微血管内皮细胞的小管生成能力。结果：小鼠/人肺特络细胞培养上清液中与血管生成相关的细胞因子水平升高,尤其是VEGF、EGF。与对照组相比,人肺特络细胞条件培养基提高了人肺微血管内皮细胞的增殖能力；与对照组相比,人肺特络细胞条件培养基促进了LPS损伤后的人肺微血管内皮细胞的小管生成能力。结论：特络细胞可以分泌VEGF、EGF,促进血管内皮细胞的增殖和损伤修复。
【作者】郑永华；
【导师】王向东；
【作者基本信息】复旦大学，呼吸内科学，2013，博士
【关键词】特络细胞；肺脏；电镜技术；免疫组化；细胞培养；小鼠；成纤维细胞；间充质干细胞；基因表达谱；微血管内皮细胞；细胞增殖；血管生成；

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