Calpain在柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎中的作用及其机制研究

【摘要】前言病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是心肌局限性或弥漫性的炎性病变,可呈急性或慢性病程。绝大多数患者预后良好；约10-15%的患者由于急性期后炎症持续、病情迁延反复,进展为扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)。在原发性扩张型心肌病中,高达60%的患者能检测到病毒感染。表明病毒直接感染是心肌炎心肌病重要的触发因素之一。多种病毒可诱导病毒性心肌炎发病,其中以肠道病毒中柯萨奇B组病毒3型(CoxsackievirusB,CVB3)最为常见,在急性心肌炎及恢复期病人体内均可检测到CVB抗体滴度升高,因此寻找CVB3导致病毒性心肌炎的治疗靶点,探寻可能的干预途径,对病毒性心脏病的治疗具有重要的临床意义。柯萨奇B组病毒引起心肌组织损伤、进展为扩张型心肌病并最终引起心力衰竭病理过程的具体机制尚不十分清楚。通常将整个过程分为三个阶段：第一阶段,病毒对心肌细胞的直接损伤；第二阶段,继发性细胞或体液免疫反应对心肌细胞的损伤；第三阶段,损伤心肌的重塑及扩张型心肌病阶段。病毒感染触发心肌组织损伤,引起持续低水平的炎症反应,导致持续性心肌损伤及修复性纤维化的发生,炎症细胞产生基质降解酶类,共同导致左心室扩张和心功能损伤,形成了病毒性心脏病“病毒性心肌炎-扩张型心肌病-慢性心力衰竭”的连续病理过程。因此,病毒持续复制、心肌炎症细胞浸润以及心肌组织纤维化是柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心脏病发病及进展的三个重要机制。Calpain是一类主要存在于细胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白酶,目前已知有15个家族成员,分为组织特异性和非特异性两大类。Calpain底物众多,生理功能复杂多样,至今尚未完全明了。通常calpain不是将蛋白质底物降解成小多肽或氨基酸,而是通过特定地限制性蛋白水解,调节受体蛋白、细胞骨架蛋白、肌原纤维、蛋白激酶等底物的活性、结构和功能,从而参与信号转导、细胞的运动与迁移、组织修复、细胞凋亡等体内生理过程；在多种病理状态下包括肌肉萎缩、某些癌症、缺血-再灌注损伤、高血压、糖尿病等,calpain的活性均增高,并在病理发病过程中起重要作用。目前,许多研究显示calpain作为一种功能多样、分布广泛的酶类,与某些种属病毒的复制过程、机体免疫炎症反应过程及组织纤维化发生三个方面均有相关性。但是,在柯萨奇B3病毒导致的病毒性心肌炎发病及进展过程中是否存在作用,又起着怎样的作用,目前尚未见报道。鉴于此,在本研究中,我们拟在目前已知的柯萨奇B3病毒导致病毒性心脏病的发病机制基础上,进一步探讨calpain在其中的具体作用及机制,以期阐明calpain作为病毒性心肌炎治疗靶点的可能性。第一部分：C57BL/6品系小鼠急、慢性病毒性心肌炎模型及扩张型心肌病模型的建立[目的]探讨以柯萨奇B3病毒(coxsackievirusB3,CVB3)感染C57BL/6小鼠建立急慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型的方法。[方法]以初始体重／周龄为依据将小鼠分为两组：A组(3-4周龄,11-15g)及B组(5-6周龄,15-20g)；每组分别下设三个病毒感染滴度亚组,即：1,000TCID50/ml亚组、10,000TCID50/ml亚组、100,000TCID50/ml亚组以及对照组。感染7天后观察心肌组织中是否存在感染病毒以及心肌炎症细胞浸润的情况,以探索建立急性病毒性心肌炎的方法。在此基础上,依照建立急性病毒性心肌炎模型的方法,以病毒直接感染的方法,感染2月及3月分别建立慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型。[结果]在急性病毒性心肌炎模型建立过程中,免疫组化染色发现病毒感染各组心肌组织中存在病毒包膜蛋白VPl；低体重组各病毒滴度感染亚组表现出较高的死亡率(40-100%),高体重组小鼠感染后各亚组体重呈下降趋势；组织病理学观察发现低体重组小鼠存活个体心肌存在炎症浸润情况,而死亡个体未发现明显炎症细胞浸润；高体重组小鼠心肌随感染病毒滴度的增高心肌炎症情况呈增高趋势,且存活率高。以建立急性病毒性心肌炎模型条件感染小鼠后2月与3月,与Balb/c品系小鼠相比,C57BL/6品系小鼠心脏功能无明显变化,心肌组织病理学未见明显炎症浸润、组织纤维化改变。[结论]利用5-6周龄/15-20g体重的C57BL/6品系小鼠,以100,000TCID50/mlCVB3、0.3ml剂量感染,可以建立急性病毒性心肌炎模型；但是通过病毒直接感染的方法,无法在C57BL/6品系小鼠建立慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型。第二部分：Calpastatin过表达对柯萨奇B3病毒感染诱导的病毒性心肌炎心脏保护作用的研究[目的]Calpain是一类存在于细胞质中的钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶,在体内底物众多,病理生理功能多样,其活性受到内源性特异性抑制剂calpastatir的负向调控。研究证明calpain参与病毒性心肌炎发病,并影响某些肠道病毒复制过程；但是关于calpain在柯萨奇B3病毒(CoxsackievirusB3,CVB3)导致的病毒性心肌炎中的作用目前尚未见报道。本研究拟利用过表达calpain内源性抑制剂calpastatin的转基因小鼠(Tg-CAST小鼠),观察calpain在CVB3诱导的病毒性心肌炎中的作用,并探讨其可能机制。[方法]以CVB3直接感染Tg-CAST小鼠建立病毒性心肌炎模型,同时设立相应对照组。观察心重／体重比值变化情况,行HE染色观察心肌组织炎症细胞浸润情况并进行病理学评分,同时检测外周血心肌损伤标志物CK-MB.cTnl的水平。分子生物学方法分别检测心肌组织中病毒包膜蛋白VP1表达水平变化；纤维化相关因子Smad3、MMP2表达及活性变化；炎症相关因子IL17、IFNy、穿孔素(perforin,PFN)表达变化。[结果]Tg-CAST小鼠心肌组织中calpastatin表达上调,calpain活性受到明显抑制。与病毒感染野生型对照相比,CVB3感染的Tg-CAST小鼠心重／体重比值降低,心肌组织炎症浸润减轻,对应心肌病理评分下降,同时外周血心肌损伤标志物CK-MB、cTnI的水平降低；心肌组织内VPl表达下降；心肌纤维化相关因子Smad3表达明显下降,MMP2表达和活性明显下降；炎症相关因子IL17、IFNy及PFN在心肌组织内的分布及表达也明显下降。[结论]以上研究说明calpastatin过表达对柯萨奇B3病毒导致的病毒性心肌炎表现出显著的心脏保护作用,提示calpain在病毒性心肌炎发病中的重要作用。病毒性心肌炎发病及进展过程中,病毒的持续复制、机体免疫炎症反应以及心肌纤维化是重要的致病机制；而围绕这三个方面展开的研究结果显示calpain参与CVB3复制,参与调控炎症因子生成,参与心肌纤维化相关因子表达；因此,calpain可能通过以上多种机制参与病毒性心肌炎发病。第三部分：Calpain介导自噬与凋亡在柯萨奇B3病毒复制中的作用研究[目的]Calpain是存在于细胞内的钙离子依赖性的中性半胱氨酸蛋白酶,参与许多生理及病理过程。有报道称calpain参与病毒复制、自噬及凋亡发生过程。然而,calpain通过自噬-凋亡串话(cross-talk)参与柯萨奇病毒复制的具体过程尚不清楚。本部分内容拟就此问题进行讨论。[方法]以CVB3直接感染培养的大鼠原代心肌细胞及H9c2心肌细胞系,建立体外病毒性心肌炎模型,分别观察感染后细胞内calpain活性、caspase3活性、细胞自噬动态变化情况；在适宜的时间窗内,通过药物调节calpain活性,观察其对细胞凋亡及自噬情况的影响；通过调节自噬活性变化,观察细胞凋亡情况的影响；在培养大鼠原代心肌细胞中,观察调节calpain活性及自噬活性,对病毒包膜蛋白VPl表达及病毒子代复制能力的影响。[结果]病毒感染后24小时内,calpain活性被持续激活。抑制calpain舌性减少了自噬的发生而增加calpain活性则促进了自噬的发生,说明calpain介导了CVB3感染过程中自噬的发生过程；在感染后10小时内,calpain活性也抑制了凋亡的发生；而在此时间段内,增强与抑制自噬分别抑制和促进了凋亡的发生,说明CVB3感染诱导的自噬抑制了细胞的凋亡；抑制calpain活性及自噬活性分别减少了病毒复制水平。[结论]在CVB3感染过程中,病毒感染激活calpain,继而通过增加自噬活性,进一步抑制宿主细胞细胞凋亡,并促进子代病毒复制。第四部分：Calpain对柯萨奇B3病毒性心肌炎心肌纤维化发生的影响及机制研究[目的]观察抑制calpain活性后急性柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌组织总体纤维化程度的改变以及体外情况下calpain对心肌成纤维细胞增殖和迁移能力的影响,初步揭示calpain在病毒性心肌炎心肌纤维化过程中的作用。[方法]以CVB3单次感染C57BL/6品系小鼠及Tg-CAST转基因小鼠建立病毒性心肌炎模型；同期小鼠腹腔无菌注射等剂量不含病毒的DMEM液作为对照组。小鼠于第7天断颈处死,取出心脏,常规方法行组织病理学行Mallory染色观察心肌纤维化程度,并测量总体纤维化面积百分比；行天狼猩红染色观察心肌胶原分布情况。无菌条件下取SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,经纯化后铺板贴壁,去血清培养24h同步化,加入含梯度稀释的ALLN,20%FBS的细胞培养基培养24h；同时设无ALLN干预的心肌成纤维细胞同条件培养作为对照组；每组设5个复孔；采用CellCountingKit-8(CCK-8)法检测不同浓度的药物对成纤维细胞增殖的影响。分组及干预同上,将成纤维细胞接种到6孔板,采用细胞划痕损伤实验检测不同浓度药物对成纤维细胞迁移的影响。[结果]急性病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的总体程度比正常对照组及药物干预组均明显增加(P<0.01)；抑制Calpain的活性后,其心肌纤维化总体程度则有显著的下降(P<0.01)。体外培养成纤维细胞实验中,与正常对照组相比低浓度的ALLN(0.625μg/ml)作用于成纤维细胞24h后,即可导致成纤维细胞的吸光度值下降,即成纤维细胞增殖率下降,差别具有显著统计学意义(P<0.001)；ALLN浓度继续增加后,成纤维细胞的吸光度继续降低,即成纤维细胞增殖率继续下降,差别有统计学意义(P<0.05)。抑制Calpain的活性同时表现出对成纤维细胞迁移能力的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.001)；随着ALLN浓度的增高,对成纤维细胞的迁移能力呈更高的抑制作用。[结论]Calpain与急性柯萨奇B3病毒性心肌炎发病中的心肌纤维化相关,并在体外情况下参与调节心肌成纤维细胞的增殖,调控成纤维细胞的迁移运动。
【作者】李明辉；
【导师】陈瑞珍；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】柯萨奇病毒；C57BL/6品系小鼠；病毒性心肌炎模型；calpastatin；calpain；心脏保护作用；凋亡；自噬；Calpain；病毒性心肌炎；心肌纤维化；

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