抗菌肽DCD-1L在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

【摘要】目的：Dermcidin(DCD)是德国科学家SchittekB等首先在人汗腺中发现的能特异表达的基因,DCD-1L是其衍生物,同样具有广谱抗菌性,为近年来国内外学者的研究热点。通过基因工程手段构建重组表达载体pET-32a-DCD-1L,在大肠杆菌transetta(DE3)中诱导表达目的蛋白,并鉴定其抑菌活性,为进一步研究其抗菌机理及实践应用研究奠定基础。方法：根据抗菌肽DCD-1L的基因序列和氨基酸序列,以及大肠杆菌对密码子的偏爱性,人工设计并合成了2条DCD-1L基因的寡核苷酸片段,利用这两条基因片段通过重叠延伸PCR(overlapextensionPCR)扩增出完整的DCD-1L编码序列,接着用酶切、连接、转化等系列方法将此基因克隆到原核表达载体pET-32a中获得重组表达载体PET-32a-DCD-1L,并通过PCR、双酶切进行验证,将初步验证正确的重组质粒进行测序鉴定。将鉴定正确的重组体转化E.colitransetta(DE3)菌株,经终浓度0.5mmol/LIPTG在低温下诱导表达后,裂解细胞后提取蛋白菌液,用SDS-PAGE分析蛋白表达状况,并用抑菌圈实验检测其表达活性。结果：经双酶切分析、DNA测序验证构建的重组质粒,证实DCD-1L基因正确地插入到pET-32a中,得到重组表达质粒pET-32a-DCD-1L;SDS-PAGE检测DCD-1L在28KDa处有目的蛋白条带,抑菌圈实验结果显示抗菌肽DCD-1L对地衣芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌及肺炎链球菌均有明显的抑制活性。结论：成功构建了重组质粒pET-32a-DCD-1L,并获得了对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌活性的抗菌肽DCD-1L,本研究为重组抗菌肽的表达和临床应用研究奠定了基础。
【作者】王炯蓉；
【导师】李志忠；廖世奇；
【作者基本信息】兰州理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】抗菌肽；DCD-1L；大肠杆菌；基因重组；抑菌活性；

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