外加磁场引导下骨髓间充质干细胞靶向修复缺血心肌的实验研究

【摘要】干细胞移植是缺血性心脏病和心力衰竭富有潜力的治疗手段,但移植细胞停留率低下严重制约了功能效应的改善,因而提高移植细胞归巢效率具有重要的现实意义。本研究立足于细胞磁靶向研究的最前沿,对外加磁场引导下骨髓问充质干细胞靶向修复损伤心肌进行了系统深入的研究。首先,在通过磁场物理学原理分析永磁铁磁场特性的基础上,对磁标记MSCs的磁响应性进行体外实验研究,发现磁标记MSCs具有很强的磁响应能力,在体外能够被磁场大量捕获,细胞捕获率随磁场强度增强而增加,随流速增加而减少,为磁靶向细胞移植的动物实验提供了理论依据；其次,通过多模态影像学和染色体错配技术对顺向冠脉注射MSCs治疗大鼠心肌损伤进行“磁场强度-疗效”关系的研究,证实外加磁场以磁场强度依赖的方式增强MSCs的停留,首次发现过高的磁场强度并未带来额外的心功能获益,呈现“细胞停留-疗效改善相分离”的矛盾现象,可能与永磁铁的磁场强度呈现横轴极化引发的细胞微栓塞有关；最后,提出经左颈内静脉插管进行小动物逆向冠脉注射细胞的新方法,在此基础上发现外加磁场能够促进心梗大鼠逆向冠脉注射MSCs的停留、植入,进一步减轻左室重塑和改善心功能,而且不存在细胞栓塞的风险。研究结果显示,细胞磁靶向治疗有望成为促进移植细胞归巢的新兴策略。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养及磁化标记目的：确定超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)和DiR荧光染料标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的合适方案。方法：分离、培养和鉴定MSCs后,首先用不同浓度的SPIO标记MSCs24h,权衡标记效率(普鲁士蓝染色、细胞透射电镜检查)和标记毒性确定合适的SPIO标记方案；再以5μg/ml的DiR工作液分别标记悬浮和贴壁状态MSCs,以DAPI标记细胞核,通过荧光显微镜观察标记效率,确定DiR的有效标记浓度。结果：(1)25,50,100μg/ml的SPIO培养液对MSCs的标记效率均接近100%(P>0.05),但是SPIO浓度由25μg/ml增加到50μg/ml时,可见较多蓝染铁颗粒黏附于细胞表面,少数游离于细胞外；当培养液SPIO浓度进一步增加到100μg/ml时,较多铁颗粒游离出细胞外,而且出现少数细胞溶解。以“25:0.75μg/mlSPIO-PLL24h方案”标记MSCs,电镜检查显示胞质内有含铁致密颗粒囊泡,细胞超微结构未见破坏。(2)依据荧光显微镜观察显示DiR记MSCs的效率接近100%,确定‘’5μg/ml的DiR工作液”能够有效标记MSCs。结论：权衡标记效率和标记毒性,确定“25:0.75μg/mlSPIO-PLL24h标记方案”和“5μg/mlDiR工作液”可高效、安全标记大鼠MSCs。第二部分永磁铁的磁场特性和磁标记间充质干细胞的体外磁响应性研究目的：阐明圆柱体永磁铁的磁场特性,明确体外静态及流态磁标记MSCs的磁响应能力。方法：对永磁铁的磁场特性进行磁场物理学分析；对静态磁标记MSCs施加0.21T的环形磁铁,通过磁共振成像及倒置相差显微镜观察细胞在磁场中的再分布；1×106磁标记MSCs以5mm/s流过一石英管,在中段管壁上分别放置0.15T、0.3T和0.6T的磁铁作为不同强度磁靶向组,对照组未放置磁铁,通过计算细胞捕获率观察不同强度磁场对流态MSCs的捕获效应；对0.6T磁靶向组分别设置4,20,100和500mm/s4种流速,观察不同流速对0.6T磁铁捕获细胞的影响。结果：通过磁场物理学分析得出永磁铁的磁场沿z轴旋转对称,半径(r)不变时,磁感应强度随z的增加而减少；z不变时,磁感应强度从中心(O)到圆柱体侧面逐渐增大,在圆柱体侧面磁感应强度最大,r再继续增大,磁感应强度又逐渐减少。静态磁标记MSCs在磁场作用下重新分布,形成与磁铁半径对应的棕色圆环,磁共振成像显示环行信号缺失区；0.15T、0.3T和0.6T的磁铁对流态磁标记MSCs的捕获率随着磁铁强度的增强而显著提高(分别为44.67%±5.5%、68%±3%和80.3%±1.5%,组间比较P均<0.05),对照组几乎没有细胞被捕获；当流速为4、20、100和500mm/s,0.6T磁铁对磁标记MSCs的捕获率随流速增加而显著减少(分别为85.0%±3.6%、68.7%±4.7%、11.3%±4.5%和1.6%±0.75%,P均<0.01),磁标记MSCs在磁场中的捕获率与流速(v)呈负相关(R=-0.770；P=0.003)。结论：磁标记MSCs具有很强的磁响应能力,在静态和流态情况下能够被磁场大量捕获；细胞捕获率随磁场强度增强而增加,随流速增加而减少；磁标记MSCs在磁场作用下呈横向极化分布,由此引起了我们对磁靶向干细胞移植可能导致或加重微栓塞的担忧。第三部分外加磁场引导下经冠状动脉顺向移植间充质干细胞治疗大鼠缺血心肌的研究目的：为了观察外加磁场对在体移植细胞的靶向停留效果,我们进行了不同强度磁场下经冠状动脉注射骨髓间充质干细胞治疗缺血再灌注大鼠的实验研究。方法：将雌性SD大鼠建立缺血再灌注模型后随机分为5组,每组25只：(1)PBS组：左室内注射PBS；(2)0T组：左室内注射MSCs,未行磁靶向；(3)0.15T组：左室内注射MSCs,使用0.15T的磁铁实施磁靶向；(4)0.3T组：左室内注射MSCs,使用0.3T的磁铁实施磁靶向；(5)0.6T组：左室内注射MSCs,使用0.6T的磁铁实施磁靶向。所有注射的MSCs均取自雄性SD大鼠,细胞量为1×106,均标记SPIO和DiR,注射期间阻断主、肺动脉5秒,对3个磁靶向组分别紧贴靶病变部位处(控制距离0-1mm)放置0.15T,0.3T和0.6T磁铁自注射开始持续至注射后10分钟。通过离体心脏荧光成像和定量PCR检测雄性MSCs的SRY基因来评估停留细胞量,通过组织形态学和心超检测评估心脏的功能学效应。结果：注射后24小时,SRY基因的RT-PCR检测结果显示0.15T、0.3T和0.6T组的细胞停留率分别是0T组的1.45倍、2.76倍和3.86倍(分别为3.75%±0.44%、7.13%±0.28%、9.95%±0.53%和2.58%±0.58%,组间比较P均<0.001),而且磁场强度与细胞停留量之间呈现正相关(R=0.983,P=0.017)。将PBS组作为阴性对照,在细胞移植后24小时,对大鼠心脏进行荧光成像,3个磁靶向组大鼠心脏均探测到比0T组更强的红色荧光(P均<0.001),其中0.6T组的荧光信号最强,0.3T组次之,0.15T组最弱,同RT-PCR的检测结果一致。在细胞移植后3周,与0T组比较,RT-PCR结果显示0.15T组和0.3T组移植细胞植入均显著增多；组织形态学分析和心超结果显示左室重塑明显减弱和左室功能显著改善,尤以0.3T组的治疗效应最强。然而,由于大量微血管栓塞,虽然0.6T组细胞停留率最高,但治疗效应与0T组无显著差别。结论：顺向冠脉移植时,外加磁场以磁场强度依赖的方式增强MSCs的停留,进而得到心脏的功能学获益,但过高的磁场强度则有加重微栓塞的风险,因而并未带来额外的心功能获益,导致“细胞停留-疗效改善相分离”的矛盾现象。第四部分外加磁场引导-下经冠状静脉逆向移植间充质干细胞治疗大鼠缺血心肌的研究目的：为了探索磁靶向能否增强逆向冠脉注射细胞的停留,我们对心梗大鼠进行了外加磁场引导下逆向冠脉注射间充质干细胞的实验研究。方法：使用雌性SD大鼠建立急性心梗模型,选用前端塑形导丝插入左颈内静脉至左侧冠状静脉,再用一导管沿导丝送达左冠状静脉近中段,对心梗大鼠逆向冠脉注射1×106MSCs,在注射期间及注射后10分钟紧贴心脏表面放置0.6T的磁铁,通过SRY基因的RT-PCR检测、心脏磁共振和离体心脏荧光成像等多模态影像学检查来评估心脏停留细胞量,通过组织形态学和心超检测评估心脏的功能学效应。结果：注射后24小时,心脏磁共振成像半定量分析显示磁靶向组大鼠左室前壁的相对信号强度低于无磁靶向组(0.61%±0.06%vs0.88%±0.08%,P<0.01),心脏离体荧光成像显示,磁靶向组荧光信号是无磁靶向组的2.73倍(26222±5102vs9620±1930,P<0.001),RT-PCR显示磁靶向组的细胞停留率是无磁靶向组的2.87倍(P<0.001)；在3周时,RT-PCR显示两组存活的移植细胞均明显下降,但磁靶向组的植入细胞仍然多于无磁靶向组(P<0.001),而且心脏形态学和心超检查显示左室重塑明显减轻,心功能显著改善。结论：磁靶向是一种增强逆向冠状静脉注射细胞停留的新方法,这一方法通过增加移植细胞停留进一步改善缺血心脏的功能,具有潜在的应用前景。
【作者】沈运丽；
【导师】钱菊英；
【作者基本信息】复旦大学，心血管内科学（专业学位），2013，博士
【关键词】靶向；磁标；大鼠；SPIO；永磁铁；缺血心肌；间充质干细胞；磁场力；移植细胞；磁共振成像；

【参考文献】
[1]全金.论法官量刑自由裁量权的行使[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[2]夏章义.砖砌体墙常用加固方法的研究[D].浙江工业大学,2013.
[3]四兵锋,赵小梅,孙壮志.城市混合交通网络系统优化模型及其算法[J].中国公路学报,2008,01:77-82.
[4]伍保红.基于ADL5317雪崩二极管系统参数测试电路的设计[D].华中师范大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[5]赵德源.SC公司市场营销战略与实施策略研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[6]胡永利.银和钯银纳米材料的可控制备及电催化性能研究[D].华侨大学,应用化学,2014,硕士.
[7]李承.幼儿园美术教育活动中幼儿提问行为的研究[D].湖南师范大学,学前教育学,2014,硕士.
[8]闫轶.中国上市公司分部报告有用性研究[D].首都经济贸易大学,会计学,2004,硕士.
[9]贾海鹏.3.0T双源射频磁共振在心脏成像中的技术优势及应用研究[D].山东大学,影像医学与核医学,2014,博士.
[10]刘波.电针对急性脑梗死大鼠神经可塑性影响的实验研究[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学,2004,硕士.
[11]王晓丽.连续春化繁殖导致大白菜冬性减弱的分子机理初探[D].东北农业大学,蔬菜学,2013,硕士.
[12]韩体育.我国职务犯罪侦查一体化机制研究[D].安徽大学,法律,2013,硕士.
[13]唐莉.免疫抑制治疗重型再生障碍性贫血的临床研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[14]胡亚春.A银行基层员工职业生涯管理研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[15]金光宇.面对小零售商户的库存路径问题的聚类算法研究[D].清华大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[16]杨淑芹.论老年人的价值、需求及老年人的社会参与[D].辽宁师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[17]田光辉.移动内容分发网络节点位置部署建模及部署方案研究[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[18]王冰.上市公司股权激励方案设计及实施问题研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]罗越楠.中国古代牌坊设计的伦理思想研究[D].武汉理工大学,设计艺术学,2013,硕士.
[20]邱立红.不同剂量辛伐他汀短期治疗对急性冠脉综合症患者内皮功能的影响[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[21]钟翔.可耐福（芜湖）有限公司市场营销策略研究[D].湖南大学,工商管理,2003,硕士.
[22]王静慧.血根碱对细菌生物被膜的作用研究[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2012,硕士.
[23]崔丽平,路永和.利用CRM提升我国证券业的竞争能力[J].商业研究,2004,11:108-109.
[24]孙靖淳.电力企业绩效考核管理系统研发[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[25]张恒.淄矿物资供应超市的设计与实现[D].西安科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[26]鱼晗.制药业品牌战略及实证研究[D].对外经济贸易大学,2005.
[27]乾勇.钢箍加固砖石古塔砌体墙抗震性能试验研究[D].扬州大学,防灾减灾工程及防护工程,2012,硕士.
[28]桂卫华,毛友志.PLC在氧化锌晶须加工中的应用[J].冶金自动化,2007,01:61-65.
[29]洪泽雄.绿色食品包装材料的发展[J].轻工科技,2015,03:22-23.
[30]贾笑英.用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建[D].甘肃农业大学,作物遗传育种,2003,硕士.
[31]朱旭.复制策略DTN路由算法在真实车辆轨迹场景中的性能评估[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[32]李孟国,曹祖德.海岸河口潮流数值模拟的研究与进展[J].海洋学报(中文版),1999,01:111-125.
[33]许庆杰.基于MODIS数据鄂尔多斯市干旱研究[D].内蒙古大学,生态学,2014,硕士.
[34]吴琼.黑龙江省工业化和信息化融合程度评估研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[35]吴帅.Partnering模式组织稳定性研究[D].郑州大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[36]程泽高.双转子对转永磁电机理论与仿真研究[D].湖南大学,电气工程,2012,硕士.
[37]苏会岚.纳米及生物放大技术用于构建高灵敏电化学免疫分析方法的研究[D].西南大学,2012.
[38]李平.韩愈讽谕诗研究[D].安徽大学,中国古代文学,2012,硕士.
[39]侯小明.FZ公司的供应商开发研究[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]许萍.矿山公园规划设计研究[D].浙江大学,2013.
[41]吕宪国.多视角下视频序列的人体特征提取与快速识别算法研究[D].山东大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[42]张骁驰.LNG船中压船舶电站的虚拟现实研究[D].大连海事大学,轮机工程,2013,硕士.
[43]蒋硕.个案研究与小学数学课堂教学效率的改进[D].东北师范大学,2005.
[44]贺德康.论股份有限公司股东大会制度与少数股东权的保护[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[45]康林,沙学富,李文涛.滚筒式切头飞剪装配[J].一重技术.2002(Z1)
[46]赛江涛.乡村旅游中的文化素材及其表达[D].北京林业大学,2005.
[47]吴单丹.新生代农民工体面劳动问题研究[D].长春工业大学,社会保障,2013,硕士.
[48]张智.多功能CAN总线电梯数字对讲与监控系统设计[D].广东工业大学,仪器仪表工程（专业学位）,2014,硕士.
[49]刘静宜.扬州剪纸艺术研究[D].河北大学,设计学,2013,硕士.
[50]韩硕.沥青混凝土路面温度应力及温缩裂缝研究[D].吉林大学,道路与铁道工程,2014,硕士.