非受体酪氨酸激酶Src在肝癌转移复发中的作用及机制研究

【摘要】肝细胞肝癌(简称“肝癌”)是临床常见的疾病,表现为恶性程度高、预后差、总体疗效不理想,严重影响了人类生命健康。虽然有手术、肝移植、射频消融术等根治性治疗手段,但肝癌的转移和复发已成为影响肝癌疗效的主要因素。临床上,由于基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等各方面的发展,也出现了很多与肝癌转移复发相关的分子,但由于肝癌转移复发涉及多基因、多途径的复杂调节,目前尚无可应用于临床的分子靶点。因此寻找关键的靶点,研究肿瘤转移复发的机制,有助于发现能有效干预肝癌转移复发的方法并进一步提高治疗效果,改善预后。Src激酶是最古老的原癌基因之一,已有许多的文献报道Src激酶与肿瘤发生密切相关,近年来Src激酶在肿瘤转移复发中的作用重新成为研究的热点,也已有特异的分子靶向药物应用于临床研究。但Src激酶在肝癌转移复发中的作用及其机制并未得到阐明。本研究拟通过研究肝癌组织标本中Src激酶的表达以及相关信号分子,并借助肝癌细胞、肝癌动物模型进一步探索Src激酶在肝癌复发转移中的临床意义,明确Src激酶在肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、转移复发中的作用及其内在机制,从而探讨干预肝癌转移的方法,以期临床转化,改善肝癌预后。第一部分Src激酶在肝癌组织中的表达及其预后意义目的：探讨Src激酶在肝癌组织中的表达及其与肝癌预后的关系。方法：收集153例肝癌根治术患者肝癌组织标本,制备成组织芯片,使用免疫组化的方法检测肝癌组织中Src、p-Src、CD44v6的表达水平,将结果与患者临床资料进行比较,分析Src、p-Src、CD44v6之间的关系及与肝癌预后的关系。使用SPSS16.0进行统计分析。结果：①p-Src在肝癌组织中过度表达与肝癌不良预后密切相关,Src、CD44v6的表达与肝癌预后无关；②p-Src与CD44v6存在相关性,在p-Src与CD44v6均过度表达的患者预后最差。结论：①p-Src是判断肝癌不良预后分子靶点；②p-Src与CD44v6的表达相关,联合p-Src与CD44v6这两个指标可预测肝癌切除术后的复发及远期生存。第二部分Src激酶在原发性肝癌转移复发中的作用及其机制研究目的：通过对不同转移潜能肝癌细胞及肝癌肺转移动物模型中Src激酶的表达及活性的研究,探讨了Src激酶在肝癌转移复发中的作用及内在机制。方法：选用三种不同的细胞系,分别为胚胎源性正常肝脏细胞(L02)、低转移潜能肝癌细胞(Hep3B)、高转移潜能肝癌细胞(MHCC-97H)Src激酶的表达：使用Src激酶抑制剂-Saracatinib作用于各个细胞系后行增殖实验、迁移、侵袭实验、克隆形成实验；用western-blotting进一步检测抑制Src激酶活性后p-Src、p-FAK、p-STAT3在肝癌细胞中的表达。通过建立肝癌肺转移的裸鼠动物模型,使用高转移潜能的MHCC97H细胞皮下接种成瘤后,接种到肝脏,使用Saracatinib干预,观察肿瘤大小及肺转移的情况,并使用免疫组化法检测原位肝癌组织的p-Src、p-FAK、p-STAT3。结果：Src激酶在高转移潜能肝癌细胞MHCC97H中表达最高,正常肝脏细胞L02中表达最低。抑制Src激酶活性可明显抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,克隆形成。在肝癌肺转移的裸鼠模型中,抑制Src激酶的活性未能抑制肝癌原发瘤的大小,但明显抑制了肝癌肺转移。体内体外实验均提示：抑制Src激酶的活性可明显抑制下游磷酸化信号FAK及Stat3的表达。结论：Src激酶与肝癌的侵袭相关,转移潜能越高,Src激酶表达越高；抑制Src激酶活性能明显抑制肝癌的肺转移。Src激酶通过调节下游FAKStat3的磷酸化信号调节肝癌细胞转移功能。Src激酶是调节肝癌转移的重要靶基因,对Src激酶的调控可成为肝癌干预的新的靶分子。第三部分Src激酶在奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞增强的侵袭转移中的作用及其机制研究一奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞侵袭转移能力的变化。目的：模拟体内化疗后残存的肝癌细胞,建立奥沙利铂化疗诱导的肝癌细胞,以了解肝癌细胞化疗后出现的恶性特征及其机制。方法：本研究使用逐步递增化疗药物浓度,间歇作用体外诱导法培养建立人肝癌奥沙利铂化疗诱导残癌细胞,通过体外实验了解细胞化疗后增殖,侵袭转移能力的改变；并使用western-blotting的方法检测p-Src、p-FAK、p-Stat3及E-cadherin、Vimentin等的变化。使用奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞接种裸鼠皮下成瘤后,接种于肝脏,观察肝脏肿瘤大小及肺转移。结果：奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞形态发生梭形样变、侵袭迁移能力增强；p-Src、p-FAK、p-Stat3表达增高,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增多。在裸鼠肝癌模型中,化疗诱导肝癌细胞肝脏原位瘤增殖增快、肺转移增加。结论：奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞侵袭转移能力增强、肺转移增加。奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞通过Src激酶及其下游磷酸化信号的激活诱导EMT发生,进而导致肿瘤侵袭转移能力增强。二、抑制Src激酶的活逆转奥沙利铂化疗后增强的侵袭转移能力目的：了解抑制Src活性能否逆转奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞增强的侵袭转移作用及其潜在的分子机制。方法：使用Saracatinib抑制奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞中Src激酶的活性,采用western-blotting检测磷酸化p-Src、p-FAK、p-Stat3及E-cadherin、Vimentin等信号的变化；体内实验使用奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞接种裸鼠,建立肝癌肺转移模型,观察给予Saracatinib干预后肝脏原位肿瘤大小及肺转移变化情况。结果：抑制奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞中Src激酶的活性后,p-Src、p-FAK、p-Stat3表达减低,E-cadherin表达增高,Vimentin表达减低；抑制肝癌肺转移裸鼠中Src激酶的活性能明显抑制肝癌肺转移。结论：抑制Src激酶的活性能逆转奥沙利铂化疗后增强的肝癌细胞侵袭转移能力,其机制是可能是通过p-Src-p-FAK-p-Stat3信号通路,逆转EME,从而抑制肝癌的转移的转移复发。
【作者】江雪梅；
【导师】任正刚；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2012，博士
【关键词】原发性肝癌；Src激酶；肿瘤转移；组织芯片；肿瘤预后；

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