癫痫特异性iPS细胞的建立及其体外诱导分化为神经元的研究

【摘要】癫痫是最常见的神经系统疾病之一,其发病机制非常复杂,至今尚未研究透彻。为了研究癫痫的发病机制,动物模型被广泛应用,但是动物模型的癫痫生理和人类不同,给应用带来了一定的限制。多能诱导干细胞(iPSCs)具备胚胎干细胞(ESCs)体外高度增殖和多向分化的能力,并且由患者成体细胞重编程获得的iPSC与供体保留着相同的遗传背景,同时解决了ESCs的来源问题,因此在再生医学和细胞替代治疗领域有着广泛的应用前景。目前,已经有将iPSCs技术应用于神经系统疾病的报道,特别是一些神经退行性疾病和神经发育异常性疾病,例如帕金森病、阿尔茨海默病和进行性脊髓性肌萎缩症等,但是将iPSCs技术应用于癫痫尚未见报道。不同类型的体细胞诱导分化为iPS细胞的效率有所不同,iPSCs也存在错误表达来源体细胞胚层的信息的风险,因此利用神经祖细胞获得iPSCs较为理想,但是利用神经外胚层细胞获得iPSCs的研究尚缺乏。本课题将分为三部分研究通过将癫痫患者来源的神经祖细胞重编程为特异性的iPSCs,这些细胞可以大量扩增,将其分化神经细胞后,我们通过分析其电生理特征,对候选的GABRG2基因进行分析,将这些具有特异性的iPS细胞应用到癫痫发病机制的研究中来。第一部分癫痫患者神经祖细胞的重编程研究目的：评价利用逆转录病毒将4种基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)转入癫痫患者神经祖细胞获得诱导多能干细胞的可行性,并将其与由该患者成纤维细胞建立的iPSC进行比较。方法：1、将接受手术的耐药性癫痫患者切除的海马组织进行分离培养,获得神经祖细胞。同时,切取部分头皮组织以获取皮肤成纤维细胞；2、逆转录病毒转染系统的建立；3、构建携带四种因子的逆病毒表达载体,制备整合GFP-Nanog启动子的神经祖细胞和成纤维细胞；4、进行转染产生iPSC;5、挑选iPS克隆,行iPSC的鉴定,包括碱性磷酸酶染色(AP)细胞及免疫组化,畸胎瘤生成实验等。结果：逆病毒转染后的第18天左右,出现类似hES细胞集落形态的iPS克隆。第25-30天,大约0.2%转染的神经祖细胞和0.1%转染的成纤维细胞呈现Nanog启动子-GFP(+)。12周后形成的iPSC克隆碱性磷酸酶染色阳性,接种到SCID小鼠可形成畸胎瘤。结论：利用逆转录病毒将4种基因转入神经祖细胞可以获得iPSC,建立的iPSC有ESC的形态和多能分化的特征。在相同条件下,诱导人神经祖细胞产生iPSC的效率高于成纤维细胞。第二部分癫痫患者iPSC体外向神经元定向分化的研究目的：研究iPSC体外向神经元定向分化的条件,并分析癫痫患者iPSC分化所得的神经元是否具有癫痫特征性的神经电生理表现。方法：1、将第一部分制备的成纤维细胞来源的iPS细胞和神经祖细胞来源的iPS细胞在MEF饲养层上进行培养；2、扩增三代以上,经胶原酶从MEF上分离；3、采用N2B27培养基诱导分化为神经元；4、对获得的神经元细胞免疫荧光分析Tuj1和MAP2表达的情况；5、膜片钳技术检测神经元异常放电和相关受体功能改变。结果：成纤维细胞和神经祖细胞来源的iPSC均可以稳定传代20代,高表达OCT4和SOX2。Tuj1阳性的细胞在诱导第2-3天即可检测到,第10天可以检测到MAP2阳性的细胞。和正常神经元对比,这些神经元自发放电的频率明显增加,部分对外源GABA的反应性降低。结论：通过N2B27培养基可在体外诱导iPSC向神经元定向分化,这些神经元自发放电的频率增加,具有癫痫患者神经元的部分特征。部分神经元对外源性GABA反应下降提示耐药性癫痫的发生机制可能和GABA受体有关。第三部分耐药性癫痫GABRG2基因突变及多态性的研究目的：通过对GABAA受体γ2亚基的GABRG2基因突变和多态性的研究,探讨耐药性癫痫可能的遗传机制。方法：接受手术治疗的耐药性癫痫患者12名,抽取外周血进行DNA提取,测定DNA浓度后PCR扩增GABRG2基因10个外显子序列,对PCR产物进行胶回收纯化,利用测序盒对其做荧光标记后进行双向测序,结果应用ChromasPro和AlignX进行分析。结果：1,3,4,6,7,10,11,12号患者发现exon3105AsnC315TAAC/AAT,C突变为T；2,3,4,5,7,8,9,10,11号患者发现exon5196AsnC588TAAC/AAT,C突变为T。AAC和AAT均为编码天冬酰胺的遗传密码。所发现的突变均为同义突变。exon3105AsnC315TAAC/AAT多态性中：C%为0.33,T%为0.67；exon5196Asn而C588TAAC/AAT多态性中：同样C%为0.25,T%为0.75。结论：对耐药性癫痫患者GABRG2基因进行研究,未发现此前文献报道的致病突变,但存在exon3105AsnC315TAAC/AAT和C588TAAC/AAT的多态性现象,提示可能与耐药性癫痫发生机制有关。
【作者】谢立乾；
【导师】朱剑虹；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2012，博士
【关键词】耐药性癫痫；神经祖细胞；成纤维细胞；诱导多能干细胞；癫痫；多能诱导干细胞；神经元；诱导分化；GABRG2；突变；多态性；

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