食蟹猴模型中sC-MSCs定向分化修复软骨缺损的实验研究

【摘要】背景软骨损伤可由关节疾病或创伤等多种原因引起,经常表现为关节疼痛、功能障碍等临床症状,严重时可导致关节功能的部分或完全丧失。患者自体软骨细胞移植被认为是一个有效的治疗方法。然而,自体软骨组织来源有限,取材需在关节镜下进行或开放手术。成熟软骨细胞扩增困难,体外培养易发生去分化现象,失去软骨形成能力；且其活性随供体年龄增长而明显下降,所获的细胞数量受到限制,达不到组织构建的要求。间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)属于多组织来源的非造血干细胞,其易于获取、扩增和定向分化,可向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞的定向分化。MSCs通过细胞与其它细胞之间的直接相互作用或分泌各种调节因子发挥其较强的免疫调节和抗炎作用,许多软骨再生的研究都基于MSCs这些特征。将用于软骨修复的MSCs准确到达需要修复的病变部位,这是基于MSCs治疗方法的关键。许多研究为了提高软骨修复的质量,报道了各种各样合成支架材料在组织工程中的应用。目前,组织工程中的支架材料主要分为人工合成生物可降解材料和天然生物可降解材料两大类。然而,许多研究者仍然关注着人工合成材料支架的长期安全性以及临床应用的可行性。本研究采用天然的脱细胞真皮基质(AcellularDermalMatrix,ADM)作为支架材料。ADM材料去除了引发免疫反应的抗原成分,完整地保留了细胞外基质的形态结构,有着良好的生物力学性能。为了更有效地将我们再生医学的基础研究向临床转化,我们选用与人类基因型和行走方式非常类似的食蟹猴(Macacafascicularis)动物模型。在此研究背景下,我们的研究目标是评估和比较多克隆MSCs(PolyclonalMesenchymalStemCells,P-MSCs)和选择性成软骨克隆化MSCs(SelectedChondrogenicClonalMesenchymalStemCells,sC-MSCs)在体外的分化、数量和表型,以及定向成软骨细胞分化能力。同时,在胶原酶诱导的食蟹猴软骨损伤模型实验中,评估在体内修复受损软骨的能力。另外,本研究还探索了一种新的软骨缺损的修复方法,运用sC-MSCs结合脱细胞真皮基质(ADM),在食蟹猴动物模型中修复软骨缺损。我们的研究目的是将选择性成软骨克隆化培养的MSCs载入脱细胞真皮基质(ADM)共同培养后,植入食蟹猴软骨缺损的动物模型中,评估其修复软骨的能力和基于MSCs治疗方法的可行性,并希望这种治疗方法可以逐渐过渡到人类的临床研究和应用。第一部分食蟹猴骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定目的探索在体外分离食蟹猴MSCs的方法;探索MSCs成软骨诱导分化培养技术；探索MSCs克隆化培养技术及成软骨阳性选择技术；研究食蟹猴的MSCs的生物学特性。材料和方法从食蟹猴骨髓中获取P-MSCs后进行分离、培养和传代。采用有限稀释法,对P-MSCs克隆化培养,获得C-MSCs。在C-MSCs中进行成软骨检测,成软骨指标高于平均值的,即阳性选择为sC-MSCs。将三种MSCs成软骨诱导分化培养和传代,然后分别进行集落形成单位测定、成软骨分化检测和流式细胞仪检测等分析比较。结果MSCs的细胞培养早期阶段,形成其独特的增殖规律。流式细胞仪分析表明,CD29、CD73和CD90作为MSCs独特的标记其表达逐代增高,而造血干细胞标记如CD45和CD34以及淋巴细胞系细胞标记如CD3、CD11和CD14的表达逐代降低；MSCs的细胞体积大小随着成软骨诱导培养时间的延长而增大。成软骨分化检测出sC-MSCs组的各代细胞中sGAG和Ⅱ型胶原的含量和表达均明显高于P-MSC组和C-MSCs组。结论本实验研究了食蟹猴骨髓源性MSCs诱导分化成软骨细胞谱系。通过不断地阳性选择,sC-MSCs表现出比P-MSCs和C-MSCs更好的成软骨特性,sGAG和Ⅱ型胶原含量和表达也相应逐代增高。第二部分脱细胞生物支架材料制备及其特性的研究目的探索天然的脱细胞真皮基质的制备方法；研究ADM的孔隙率和生物力学特性；探索sC-MSCs与ADM定向分化成软骨培养技术；研究sC-MSCs结合ADM支架材料的生物学特性。材料和方法选用食蟹猴的皮肤作为原料,采用化学、物理和生物综合技术制备ADM支架材料,并对其进行孔隙率和生物力学检测。用三明治法将sC-MSCs与ADM复合培养并定向诱导分化成软骨,然后分别进行扫描电镜观察、激光扫描共聚焦显微镜观察和成软骨分化检测等分析比较。结果ADM的孔隙率为80.26%。ADM的拉伸强度为4.52MPa。将sC-MSCs种植在ADM上,经过21天的体外培养,sGAG(sulfatedglycosaminoglycans,硫酸糖胺聚糖)的平均值为4.6±0.9μg/mg,与第三天的sGAG值为1.1±0.2μg/mg相比,差异有统计学意义。Ⅱ型胶原的含量第21天也比第3天增加(6.2±0.9μg/mgvs.2.4±0.6μg/mg),差异有统计学意义。扫描电镜观察和激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,ADM为sC-MSCs的增殖和分化提供了充足的空间,sC-MSCs种植在ADM支架中分布均匀,并且长期存活,具有良好的生物细胞相容性。结论本研究结果提示,未发现ADM支架材料有细胞毒性,同时具有较为合适的空隙率,更利于植入细胞的黏附与增殖；在处理过程中,能保持ADM的生物力学性能。sC-MSCs-ADM具有良好的成软骨定向分化的能力。因此,脱细胞真皮基质可以作为一种修复软骨缺损理想的支架材料。第三部分MSCs修复胶原酶诱导的食蟹猴软骨损伤目的评估和比较多克隆MSCs(PolyclonalMesenchymalStemCells,P-MSCs)和选择性成软骨克隆化MSCs(SelectedChondrogenicClonalMesenchymalStemCells,sC-MSCs)在体外的分化、数量和表型,以及定向分化为软骨细胞的能力。通过体外实验,明确MSCs对软骨的粘附能力和最佳时间。同时,在胶原酶诱导的食蟹猴软骨损伤模型实验中,评估在体内修复受损软骨的能力。材料和方法选用健康的3-5岁的雄性食蟹猴,随机分成三组：NS组(生理盐水对照组),P-MSCs组和sC-MSCs组,每组3只。获取骨髓源性的P-MSCs和sC-MSCs,通过MSCs在软骨粘附能力的体外实验得到细胞粘附的最佳时间。用胶原酶诱导食蟹猴软骨损伤模型,然后通过MSCs局部细胞粘附的方法分别植入P-MSCs和sC-MSCs,用NS(生理盐水)作为对照组。在8周、16周和24周分别进行关节的大体观察、X线成像、组织学染色、透射电子显微镜观察,用WesternBlot法检测和组织学评分来评估软骨的修复情况。结果实验表明,MSCs在体外黏附模型中,平均69.00±8.8%的MSCs在10分钟内粘附到软骨缺损处,然后保持在稳定的水平。经过MSCs的治疗24周后。对关节软骨进行大体观察、X线成像、组织学染色、透射电子显微镜观察,用WesternBlot法检测和组织学评分,发现P-MSCs组和sC-MSCs组关节软骨修复情况明显优于对照组,尤其是sC-MSCs组的修复情况最佳。结论我们的研究结果表明,sC-MSCs可以在胶原酶诱导的食蟹猴软骨损伤动物模型中显著改善软骨损伤。由于人类与食蟹猴的基因及行走方式非常相似,使用此模型的实验结果对于修复骨关节炎患者软骨损伤具有潜在的应用价值。第四部分MSCs结合ADM修复食蟹猴软骨缺损目的运用选择性成软骨克隆化培养的MSCs结合脱细胞真皮基质(ADM),在食蟹猴动物模型中修复软骨缺损,探索一种新的软骨修复的方法。将选择性成软骨克隆化培养的MSCs载入真皮脱细胞基质(ADM)共同培养后,植入食蟹猴软骨缺损的动物模型中,评估其修复软骨的能力和基于MSCs的细胞治疗方法的可行性,并希望这种治疗方法可以逐渐过渡到人类临床研究和应用。材料和方法选用健康的3-5岁的雄性食蟹猴,随机分成三组：NS组(生理盐水对照组),sC-MSCs组(或简称MSCs组)和sC-MSCs-ADM组(或简称MSC+ADM组),每组3只。获取骨髓源性的sC-MSCs,并制备ADM,将sC-MSCs与ADM三明治法复合培养。用钻孔法诱导食蟹猴软骨缺损模型,然后分别植入sC-MSCs和sC-MSCs-ADM,用NS(生理盐水)作为对照组。在8周,16周和24周分别进行关节的大体观察、组织学染色、免疫组化染色和组织学评分评估软骨缺损的修复情况。结果经过MSCs的治疗,24周后关节软骨通过大体观察、组织学染色、免疫组化染色和组织学评分发现sC-MSCs组和sC-MSCs-ADM组软骨缺损修复情况明显优于对照组,尤其是sC-MSCs-ADM组的修复情况最佳。结论我们的研究表明,sC-MSCs结合ADM支架在食蟹猴动物模型中可以有效地修复软骨缺损。由于人类与食蟹猴的基因及行走方式非常相似,此模型的实验结果对于临床修复软骨缺损具有潜在的应用价值。
【作者】蒋励；
【导师】俞永林；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2012，博士
【关键词】间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)；定向分化(DirectionalDifferentiation)；克隆化培养(ClonalCulture)；成软骨诱导(ChondrogenicInduction)；食蟹猴(Macacafascicularis)；脱细胞真皮基质(AcellularDermalMatrix,ADM)；软骨修复(CartilageRepair)；间充质干细胞(MesenchymalStemCells；MSCs)；胶原酶(Co11agenase)；软骨缺损(CartilageDefect)；

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