新型药物载体LyP-1-MWNTs应用于胰腺癌淋巴转移靶向治疗的实验研究

【摘要】目的：设计、制备用于胰腺癌淋巴靶向化疗的新型载体：LyP-1-MWNTs,分析该载体的理化特性；并通过体内、体外实验,研究其携载吉西他滨（GEM）后靶向治疗胰腺癌淋巴转移的效果和机制。方法：（1）实验采用Fmoc/tbu固相多肽合成技术合成LyP-1多肽,使用5-FAM进行荧光标记,利用高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）对其进行表征。采用混酸处理法制备截短的羧基化MWNTs（Cut-MWNTs）,通过氨基与羧基的缩合反应共价枝接Maleimide-PEG-NH2,再通过巯基和马来酰亚胺的特异性反应及碘氧化的方法制备LyP-1-MWNTs复合载体（LyP-1-conjugatedMulti-walledCarbonNanotubes）,观察该复合载体在水中的分散性和稳定性,并利用热重分析（TGA）、透射电镜（TEM）对复合物进行表征。（2）以5-FAM组、LyP-1预处理组为对照,利用荧光显微镜和流式细胞仪观察人胰腺癌细胞株BxPC-3、淋巴结高转移特性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN5对5-FAM标记的LyP-1多肽的体外靶向摄取差异。通过MTT法检测不同浓度和不同时间条件下,复合载体LyP-1-MWNTs携载吉西他滨（GEM）后对BxPC-3-LN5细胞生长的体外抑制作用,并用流式细胞仪检测细胞周期分布、增殖指数和凋亡率。（3）构建裸鼠胰腺癌淋巴道转移模型,通过尾静脉、足垫下注射不同给药途径,采用免疫荧光染色法观察5-FAM-LyP-1、5-FAM-LyP-1-MWNTs对肿瘤转移淋巴结内淋巴管的靶向亲和性。观察不同处理组裸鼠肿瘤接种侧胭窝、腹股沟、髂动脉旁、肾门淋巴结黑染情况,结合淋巴结病理切片（HE染色）,评估LyP-1-MWNTs的淋巴示踪性。通过比较各组胭窝淋巴结体积、重量的差异,检测LyP-1-MWNTs-GEM对胰腺癌淋巴结转移灶的体内抑瘤效应；采用EnVision法以及TUNEL法检测胭窝淋巴结内肿瘤细胞的增殖和凋亡。检测不同处理组裸鼠血常规、肝功能、肾功能等指标,并取裸鼠心、肝、脾、肺、肾等重要器官行HE染色观察组织损伤情况,探讨复合载体LyP-1-MWNTs的毒副作用。结果：（1）LyP-1-MWNTs合成制备：原始碳纳米管经过混酸处理完成羧基化修饰并被截短,TEM表征显示Cut-MWNTs依旧保持清晰的管状结构,长度100-200nm,直径30-40nm；相比原始碳管,其水中的分散性和稳定性明显提高,室温下静置3个月也无沉淀发生。采用Fmoc/tbu固相合成技术制备的LyP-1、5-FAM-LyP-1多肽,通过MS表征其分子量得知多肽已成功制备,经过纯化后HPLC测试多肽纯度均达到98%以上；LyP-1与Cut-MWNTs通过Maleimide-PEG-NH2完成共价枝接得到复合载体LyP-1-MWNTs,TGA分析显示聚合物的枝接率可达10.2%,TEM观察到LyP-1-MWNTs表面有聚合物包裹,故发生轻度缠绕,但是与Cut-MWNTs相比,并未影响其水中分散性和稳定性。（2）LyP-1-MWNTs的体外靶向作用：人胰腺癌细胞株BxPC-3、淋巴结高转移特性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN5对5-FAM标记的LyP-1多肽均具有极高的体外靶向摄取,但差异不明显,且给予游离LyP-1预处理后,可竞争性结合细胞膜表面的LyP-1特异性受体而使5-FAM-LyP-1摄取量明显下降。空白MWNTs载体对细胞增殖抑制率轻微,生物相容性好；MWNTs对GEM的物理吸附载药并未出现药效的减损,甚至体外抗肿瘤细胞增殖效应优于GEM单药（P<0.05）;LyP-1多肽发挥主动靶向效能,具有一定的时间和浓度依赖性,体现在较高药物浓度水平、相对较长时间点时,出现较MWNTs-GEM、GEM更强的细胞毒作用,使细胞大量阻滞于G0/G1期,明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。（3）LyP-1-MWNTs的体内靶向作用：选取淋巴结高转移特性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN5,采用爪垫皮下注射法构建裸鼠胰腺癌淋巴道转移模型,发现种瘤侧胭窝、髂动脉旁及双侧腹股沟淋巴结发生肿瘤转移；5-FAM-LyP-1（尾静脉注射）、5-FAM-LyP-1-MWNTs（爪垫下注射）给药后,所含LyP-1均能与转移淋巴结中肿瘤淋巴管发生特异性结合；LyP-1-MWNTs对淋巴结的示踪性优于MWNTs,其引流途径上的胭窝、腹股沟、髂动脉旁、肾门淋巴结均出现明显黑染,显微镜下可见大量黑色碳管颗粒聚集于肿瘤转移灶周围。LyP-1-MWNTs-GEM的体内靶向抗淋巴转移灶疗效显著优于GEM与MWNTs-GEM,该组胭窝淋巴结体积最小、肿瘤细胞免疫组化阳性指数最低、凋亡指数（AI）最高（P<0.05）；含MWNTs各组裸鼠爪垫注射部位皮肤有黑染,但是裸鼠健康状况良好,体重、血常规、血生化指标与其余各组相比无显著差异（P>0.05）,心、肝、脾、肺、肾等重要器官病理学检测均未发现明显组织损伤和碳管材料的沉积,提示碳纳米管材料具有良好的安全性和生物相容性。结论：LyP-1-MWNTs是一种新型的靶向药物载体,具备良好的生物相容性和极佳的淋巴靶向亲和性和流动性。体内外实验证实,LyP-1-MWNTs携载GEM后具有比GEM单药和MWNTs-GEM更好的抑制胰腺癌淋巴转移效应,是一种具有潜在应用价值的用于胰腺癌淋巴化疗的主动靶向递药系统。
【作者】王强；
【导师】傅德良；
【作者基本信息】复旦大学，外科学（专业学位），2012，博士
【关键词】胰腺癌；淋巴转移；碳纳米管；吉西他滨；LyP-1；靶向治疗；淋巴化疗；药物载体；

【参考文献】
[1]王光祖.拓展应用技术领域促纳米金刚石发展[J].超硬材料工程,2015,01:25-30.
[2]陈军.公共网络舆情危机传播管理研究[D].安徽大学,公共管理,2012,硕士.
[3]旷远文,温达志,周国逸,张德强.鼎湖山异龄马尾松针叶长度序列元素分布[J].植物生态学报,2006,01:33-39.
[4]何艳艳.BDNF对小脑间位核投射神经元GABA能神经传递的调控及其受体机制的研究[D].南京大学,生理学,2013,硕士.
[5]刘海.试论社会主义时期宗教的作用[D].中共中央党校,科学社会主义,2004,硕士.
[6]李志国.（Z_2）～k作用与最小法丛信息量[D].河北师范大学,应用数学,2004,硕士.
[7]段惠子.翁方纲著作研究[D].复旦大学,历史文献学,2011,博士.
[8]杨颖,徐磊,冯井荣.中外合作办学存在的问题探析——以云南师范大学为例[J].大学教育,2013,01:7-9.
[9]杨大为.“当时之药石，后世之攻错”—袁枚诗歌批评研究[D].华中师范大学,文艺学,2013,硕士.
[10]姜帆.五味子多糖的提取纯化及其对肠道免疫功能的影响[D].东北农业大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[11]纪薇薇.纤维超空间的可数紧性[D].辽宁师范大学,基础数学,2012,硕士.
[12]张丽萍.电压互感器二次线路压降的产生机理及治理措施[D].华北电力大学（北京）,电气工程,2004,硕士.
[13]余赟.适于甘薯淀粉高产L-乳酸米根霉菌株的选育[D].合肥工业大学,农产品加工及贮藏工程,2004,硕士.
[14]李牧原.第二届南京电影论坛综述[J].南京师范大学文学院学报,2014,03:110-115.
[15]陈建英,刘心松,唐宏斌,谭颖.基于位置索引的电力信息系统资源共享方案[J].电力系统自动化,2010,07:57-60.
[16]方德明,高增梁,孙伟明,张康达.制氢炉出口集合管破裂失效分析[J].中国锅炉压力容器安全,1999,01:6-8.
[17]韩冰.神华宁夏煤业集团煤化工分公司设备管理研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[18]赵睿瑞.组合梁—钢框架刚度及承载力研究[D].青岛理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]罗福龙.遥测地震仪器潜力探讨[J].石油仪器,2001,01:6-9+59.
[20]丁然.电子车牌在北京市道路交通管理中的适应性研究[D].北京交通大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[21]顾红.一类描述PEPA模型的反应扩散问题[D].扬州大学,应用数学,2012,硕士.
[22]刘亚静.《交流伺服控制系统》系列讲座(一)第1讲电机基本定律及相关概念[J].伺服控制,2014,02:67-70.
[23]曹洪岩.高校财务数据仓库系统的研究和应用[D].大连海事大学,2004.
[24]闫芙蓉.改进型UPQC检测方法研究[D].太原科技大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[25]万鲁涛.论《侵权责任法》第69条的适用[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[26]谭俊玲.小鼠生精细胞与支持细胞自噬与自噬诱因的初步研究[D].山东大学,发育生物学,2013,硕士.
[27]刘壮.ABS系统动力学仿真分析[D].东北大学,车辆工程,2009,硕士.
[28]米红,曾东海,杨帆.统计数据仓库建设模式研究[J].统计与决策,2005,19:47-50.
[29]俞甜.La_(0.6)Sr_(0.4)Fe_(1-x)M_xO_(3-α)(M=Mo,Nb)阴极材料的制备与电化学性能[D].苏州大学,无机化学,2014,硕士.
[30]秦虹.改良股薄肌转移代外括约肌行肛门重建术治疗小儿肌原性大便失禁[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[31]陈庆全.MECAMIX烧伤药对烧伤创面的治疗效果[D].广西医科大学,药理学,2013,硕士.
[32]徐晓华.城市体育公园规划设计探究[D].浙江大学,风景园林（专业学位）,2012,硕士.
[33]杨恶恶,王坚强,马超群,汪新凡.基于云发生算法的犹豫语言多准则决策方法[J].控制与决策,2015,02:371-374.
[34]李颖婕.5个木兰科植物杂交后代的生殖生物学研究[D].云南农业大学,果树学,2014,硕士.
[35]丁科.肠外瘘病理生理学分型的可行性研究[D].华中科技大学,外科学,2013,硕士.
[36]许琳,王蓓,张晖.关于农村残疾人的社会保障与社会支持现状研究[J].南京社会科学,2006,05:97-105.
[37]王柳,张希威,邵智斌,揭建胜.基于硅与二硫化钼异质结的高性能可见光到近红外光电探测器[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第17分会：光电功能器件[C].中国化学会:,2014:1.
[38]密永娟,王金清,杨生荣.还原氧化石墨烯/氧化锆纳米复合薄膜的制备及其摩擦学性能的研究[A].中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室、中国机械工程学会摩擦学分会.第十一届全国摩擦学大会论文集[C].中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室、中国机械工程学会摩擦学分会:,2013:1.
[39]余卫军.分数O-U过程的贝叶斯分析及其应用[D].华东师范大学,概率论与数理统计,2004,硕士.
[40]张双狮.海洋可控源电磁法三维时域有限差分数值模拟[D].成都理工大学,2013.
[41]刘文干.三株红壤高效溶磷菌的分离、鉴定、溶磷特性及其对花生促生效应的研究[D].南京农业大学,微生物学,2012,硕士.
[42]房超琦.花生优质化学突变体的诱发与高油酸突变体的分子鉴定[D].吉林农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[43]陈一航.基于数据挖掘技术的乡镇电信业套餐可选包销售定位研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[44]朱允广.废旧磷酸铁锂的回收及过渡金属氧化物负极材料的研究[D].浙江大学,材料工程（专业学位）,2013,硕士.
[45]叶晓.中国英语学习者汉语句法的二语逆向迁移研究[D].南京理工大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[46]刘明珠.化学液相法合成纳米硒[D].安徽大学,无机化学,2004,硕士.
[47]吴怡然.民间公益组织对农民工进行家长教育的实践研究[D].华东师范大学,教育学原理,2013,硕士.
[48]丁颜颜.用于紫外光电器件高质量AlN模板的MOCVD生长[D].华中科技大学,光学工程,2013,硕士.
[49]杜薇.DEM建模及空间分析的设计与实现[D].大连理工大学,2004.
[50]王丹莉.多模态隐喻的认知研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.